مقدمة
الليزوزيم أو الموراميداز هو اسم مجموعة من الإنزيمات التي تقوم بتحليل الببتيدوغليكان المائي، وهو جزيء هيكلي كبير يتكون من السكريات والأحماض الأمينية، ويشكل طبقة واقية على الجدار الخارجي للخلايا البكتيرية. ينتشر الليزوزيم على نطاق واسع في الطبيعة، فهو موجود في الحيوانات والنباتات والبكتيريا، وكذلك في الفيروسات البكتيرية. وهو جزء من الجهاز المناعي الفطري الذي يعمل ضد العدوى البكتيرية. يمكن العثور عليه في إفرازات الجسم مثل اللعاب والدموع والأنسجة وكذلك في الأعضاء. ونظرًا لنشاطه المضاد للبكتيريا والفطريات، فإن الليزوزيم له إمكانات في التطبيقات السريرية والأعلاف والأغذية [2]. كما يتم تطبيقه على نطاق واسع كجزيء نموذجي للتحقيق في بنية البروتين واستقراره ووظيفته في العديد من الأبحاثarcح [3].
الليزوزيم هو بروتين كروي small ذو بنية كيميائية متشابهة في الكائنات الحية المختلفة التي يتواجد فيها، انظر الشكل 1. تُصنف الأنواع المختلفة من الليزوزيمات إلى ثلاث عائلات رئيسية: نوع الدجاج، ونوع الغوسيتيزيم، ونوع اللافقاريات. تُصنف الليزوزيمات البشرية والدجاج على أنها من نوع الدجاج وهي متطابقة بنسبة 60% تقريبًا في تسلسل الأحماض الأمينية، في حين أن الليزوزيمات البشرية تتكون من 129 بقايا الأحماض الأمينية (14.3 كيلو دالتون)، بينما تحتوي الليزوزيمات البشرية على 130 (14.7 كيلو دالتون). بياض بيض الدجاج هو المصدر التجاري الرئيسي لليزوزيم [2،3]. ينشط ما يسمى بليزوزيم بياض بيض الدجاج (HEWL) في نطاق large من الأس الهيدروجيني (6 - 9) ويمثل درجة حرارة انصهار/انتقال، Tm، تبلغ 72 درجة مئوية عند الأس الهيدروجيني 5.0 [4].
يتم تطبيق DSC largely لدراسة الاستقرار الحراري للبروتينات وتركيبات البروتين. ويعد تفكيك البروتين تأثيرًا ماصًا للحرارة ناتجًا عن تعرض مجموعاته الكارهة للماء إلى medium المائي. ولذلك، بالنسبة للبروتينات في المحاليل، غالبًا ما تُلاحظ ذروة امتصاص الحرارة في منحنى DSC، ويُشار إلى ذروتها القصوى في الأدبيات باسم درجة حرارة الذوبان/الانتقال (Tm). يمكن أن يكون التمسخ الحراري (تكشف البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين) قابلًا للانعكاس أو غير قابل للانعكاس، اعتمادًا على خصائص البروتين وعلى ظروف medium ، الشكل 2 [5]. Medium تشمل الظروف التي تؤثر على قابلية انعكاس التمسخ، على سبيل المثال، تركيز البروتين، ودرجة الحموضة، وقوة Ionic ، ودرجة الحرارة. لذلك من المتوقع أن تؤثر التغييرات في بنية البروتين أو في التركيبة medium على قابلية البروتينات للتغير الحراري، وهو ما ينعكس في درجة الحرارة المقاسة Tm.
يقيس DSC مباشرةً الامتصاص الحراري المرتبط بعملية التكشف. إنها طريقة موثوق بها لتحديد الخصائص الديناميكية الحرارية للبروتين الأصلي لتوصيف البروتينات التي خضعت لتعديلات هيكلية أو للوصول إلى الاستقرار الحراري لتركيبات البروتين للاستخدام العلاجي.
تجريبي
طريقة تحضير العينة
تم ذوبان الليزوزيم1 في ماء مقطر ومصفى2 بتركيزات 300 مجم/مل و200 مجم/مل و24 مجم/مل و5 مجم/مل. تم سكب 20 ميكرولتر من كل تركيز في Concavus® بوتقة3 تم إغلاقها على الفور. بالنسبة للمحلول عند 24 مجم/مل، تم أيضًا تحليل حجم 5 ميكرولتر. تم إجراء ثلاثة قياسات على الأقل على كل عينة. تم ملء البوتقة المرجعية بنفس الحجم من الماء المقطر المرشح. تم إجراء القياسات تحت جو خامل (N2 الديناميكي، 40 مل/دقيقة) بمعدل تسخين 10 كلفن/دقيقة.
1 الليزوزيم بياض بيضة الدجاجة البيضاء، ≥ 45000 وحدة/مجم، مجفف بالتجميد، 14 كيلو دالتون، Carl Roth GmbH + Co KG
2 بولي إيثر سلفون - مرشح غشاء PES، 450 ميكرومتر
3 Concavus® 40 ميكرولتر بوتقات ألومنيوم، NETZSCH-Gerätebau GmbH
نتائج القياس والمناقشة
تُظهر منحنيات DSC للمحاليل المائية لليزوزيم الليزوزيم التأثير الماص للحرارة الأحادي النموذجي في نطاق 75 درجة مئوية لجميع التركيزات المقاسة. ويوضح الشكل 3 المنحنيات النموذجية للمحاليل بتركيزات 300 و200 و20 مجم/مل. تختلف درجة حرارة البداية الاستقرائية ودرجة حرارة الذروة (Tm) والمساحة تحت المنحنى (الإنثالبي) باختلاف التركيز. كلما زادت كتلة العينة في البوتقة، اتسع التأثير الماص للحرارة. ويلاحظ تأثير الاتساع أثناء تباين درجات حرارة البداية والذروة المستنبطة وكذلك الإنثالبي. وتمثل التركيزات المختارة العقاقير البروتينية العلاجية العادية، والتي عادةً ما تكون عالية التركيز، مع إعطاء جرعة البروتين بوحدة ملغم/كغم من وزن الجسم. ويوضح الشكل 4 تأثير حجم العينة من خلال عرض منحنيات DSC للمحاليل عند 20 مجم/مل (5 ميكرولتر) وعند 5 مجم/مل (20 ميكرولتر).
كانت الكتل المعنية 0.13 مجم و0.10 مجم. تم تلخيص نتائج جميع القياسات في الجدول 1.
الجدول 1: توصيف الليزوزيم بواسطة DSC: التركيز، وكتلة البروتين، وأحجام العينات المقاسة ودرجات حرارة الانتقال (القمم) والإنثالبي (المناطق) ذات الصلة
التركيز (ملغم/مل) | حجم العينة (ميكرولتر) | التركيز (مليمتر) | كتلة البروتين (ملغم) | المساحة (جول/غم) | الذروة (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
الملخص
في هذه الدراسة، تم استخدام DSC 300 Caliris® لفحص درجة حرارة انتقال الليزوزيم في نطاق واسع من التركيزات، من 5 إلى 300 مجم/مل، وهو ما يمثل تركيبات البروتين المتاحة تجاريًا. وعلى الرغم من استخدام المحاليل عالية التركيز، إلا أن القياس على أحجام small مثل 5 ميكرولتر سمح بتوفير التركيبات باهظة الثمن مع إمكانية التكرار العالية.
كما أن حساسية المستشعر وإمكانية استخدام small أحجام في حدود بضعة ميكرولترات، إلى جانب إمكانية وجود مغير آلي للعينة، تجعل من DSC تقنية قيّمة لتحليل الجزيئات الحيوية. واعتمادًا على معدل التسخين/التبريد، يمكن أن تصل الإنتاجية إلى 3 عينات في الساعة.