Bevezetés
A lizozim vagy muramidáz egy olyan enzimcsoport neve, amely hidrolizálja a peptidoglikánokat, egy cukrokból és aminosavakból álló szerkezeti makromolekulát, amely a baktériumsejtek külső falának védőrétegét alkotja. A lizozim széles körben elterjedt a természetben, jelen van állatokban, növényekben, baktériumokban és bakteriofág vírusokban is. A baktériumfertőzés ellen ható veleszületett immunrendszer része. Megtalálható a testváladékokban, mint a nyál és a könny, a szövetekben és a szervekben is. Antibakteriális és gombaellenes aktivitása miatt a lizozim potenciálisan alkalmazható a klinikai, takarmányozási és élelmiszeripari alkalmazásokban [2]. Emellett széles körben alkalmazzák modellmolekulaként a fehérjék szerkezetének, stabilitásának és működésének vizsgálatára számos kutatási területen [3].
A lizozim egy small globuláris fehérje, amelynek kémiai szerkezete hasonló a különböző élőlényekben, amelyekben jelen van, lásd az 1. ábrát. A különböző típusú lizozimeket három fő családba sorolják: csirke-típusú, libatípusú és gerinctelen típusú. Az emberi és a csirke lizozimeket a csirke-típusúak közé soroljuk, aminosav-szekvenciájuk közel 60%-ban megegyezik, míg a csirke lizozim 129 aminosavmaradványból áll (14,3 kDa), az emberi lizozim 130-ból (14,7 kDa). A tyúktojásfehérje a lizozim fő kereskedelmi forrása [2,3]. Az úgynevezett tyúktojásfehérje-lizozim (HEWL) a large pH-tartományban (6-9) aktív, és 72°C-os olvadási/átmeneti hőmérsékletet (Tm) képvisel pH 5,0-nál [4].
A DSC-t nagymértékben alkalmazzák a fehérjék és fehérjeformulációk HőstabilitásEgy anyag hőstabil, ha a hőmérséklet hatására nem bomlik el. Egy anyag hőstabilitásának meghatározására a TGA (termogravimetriás analizátor) egyik módja. hőstabilitásának vizsgálatára. A fehérje kibontakozása egy endoterm hatás, amely a fehérje hidrofób csoportjainak a vizes medium kitettségéből adódik. Ezért az oldatban lévő fehérjék esetében a DSC-görbén gyakran megfigyelhető egy hőelnyelési csúcs, amelynek csúcsmaximumát a szakirodalom olvadási/átmeneti hőmérsékletnek (Tm) nevezi. A termikus denaturáció (a fehérje 3 dimenziós szerkezetének kibomlása) lehet reverzibilis vagy irreverzibilis, a fehérje jellemzőitől és a körülményektől függően medium, 2. ábra [5]. Medium A denaturáció reverzibilitását befolyásoló körülmények közé tartozik például a fehérje koncentrációja, a pH, a Ionic erőssége és a hőmérséklet. Ezért várható, hogy a fehérje szerkezetében vagy a formulációban medium bekövetkező változások befolyásolhatják a fehérjék termosztabilitását, ami a mért Tm-ben tükröződik.
A DSC közvetlenül a kibontakozási folyamathoz kapcsolódó hőfelvételt méri. Megbízható módszer a natív fehérje termodinamikai jellemzőinek meghatározására a szerkezeti módosításokon átesett fehérjék jellemzésére vagy a terápiás célú fehérjeformulák HőstabilitásEgy anyag hőstabil, ha a hőmérséklet hatására nem bomlik el. Egy anyag hőstabilitásának meghatározására a TGA (termogravimetriás analizátor) egyik módja. hőstabilitásának elérésére.
Kísérleti
Minta előkészítési módszer
A lizozimet1 desztillált és szűrt2 vízben 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml és 5 mg/ml koncentrációban oldottuk. minden koncentrációból 20 μl-t pipettáztunk a Concavus®tégelyekbe3, amelyeket azonnal lezártunk. A 24 mg/ml-es oldat esetében 5 μl térfogatot is elemeztünk. Minden mintán legalább három mérést végeztünk. A referenciatégelyt ugyanolyan térfogatú desztillált, szűrt vízzel töltöttük meg. A méréseket inert légkörben (dinamikus N2, 40 ml/perc) végeztük 10 K/perc fűtési sebességgel.
1 Tyúktojásfehérje lizozim, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizált, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Poliéter-szulfon - PES membránszűrő, 450 μm
3 Concavus® 40 μl-es alumínium tégelyek, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Mérési eredmények és megbeszélés
A lizozim vizes oldatainak DSC-görbéi minden mért koncentráció esetében a 75°C-os tartományban a tipikus egyszeri endoterm hatást mutatják. A 3. ábra 300, 200 és 20 mg/ml koncentrációjú oldatok tipikus görbéit mutatja. Az extrapolált kezdeti hőmérséklet, a csúcshőmérséklet (Tm) és a görbe alatti terület (entalpia) a koncentráció függvényében változik. Minél nagyobb a tégelyben lévő minta tömege, annál szélesebb az endoterm hatás. A kiszélesedő hatás az extrapolált kezdeti és csúcshőmérséklet, valamint az entalpia változása során figyelhető meg. A választott koncentrációk reprezentatívak a szokásos terápiás fehérje drogokra, amelyek általában nagy koncentrációjúak, a fehérje adagját testtömeg mg/kg-ban adtuk meg. A 4. ábra a mintatérfogat hatását mutatja be a 20 mg/ml (5 μl) és az 5 mg/ml (20 μl) oldatok DSC-görbéinek megjelenítésével.
A megfelelő tömegek 0,13 mg és 0,10 mg voltak. Az összes mérés eredményeit az 1. táblázatban foglaltuk össze.
1. táblázat: A lizozim jellemzése DSC-vel: koncentráció, fehérjetömeg, a mért minták térfogata és a megfelelő átmeneti hőmérsékletek (csúcsok) és entalpiák (területek)
Koncentráció (mg/ml) | Minta térfogata (μl) | Koncentráció (mM) | Fehérje tömege (mg) | Terület (J/g) | Csúcs (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Összefoglaló
Ebben a tanulmányban a DSC 300 Caliris® készüléket használták a lizozim átmeneti hőmérsékletének vizsgálatára széles koncentrációtartományban, 5 és 300 mg/ml között, ami reprezentatív a kereskedelemben kapható fehérjeformulákra. Bár nagy koncentrációjú oldatokat használtunk, a small 5 μl-es térfogatokon végzett mérés lehetővé tette a drága készítmények megtakarítását nagy reprodukálhatóság mellett.
A szenzor érzékenysége és a small néhány mikroliteres térfogatok használatának lehetősége, valamint az automatizált mintaváltó lehetősége a DSC-t értékes technikává teszi a biomolekulák elemzésében. A fűtési/hűtési sebességtől függően az átviteli sebesség elérheti az óránkénti 3 mintát is.