Pendahuluan
Lisozim, atau muramidase, adalah nama sekelompok enzim yang menghidrolisis peptidoglikan, makromolekul struktural yang terdiri dari gula dan asam amino, membentuk lapisan pelindung pada dinding luar sel bakteri. Lisozim tersebar luas di alam, terdapat pada hewan, tumbuhan, bakteri, dan juga virus bakteriofag. Ini adalah bagian dari sistem kekebalan tubuh bawaan yang bekerja melawan infeksi bakteri. Ini dapat ditemukan dalam sekresi tubuh seperti air liur dan air mata, jaringan, dan juga dalam organ. Karena aktivitas antibakteri dan antijamurnya, lisozim memiliki potensi dalam aplikasi klinis, pakan, dan makanan [2]. Hal ini juga banyak digunakan sebagai molekul model untuk penyelidikan struktur protein, stabilitas dan fungsi di beberapa bidang penelitian [3].
Lisozim adalah protein globular small dengan struktur kimia yang sama pada berbagai makhluk hidup yang berbeda, lihat gambar 1. Berbagai jenis lisozim diklasifikasikan ke dalam tiga keluarga utama: tipe ayam, tipe angsa, dan tipe invertebrata. Lisozim manusia dan ayam diklasifikasikan sebagai tipe ayam dan hampir 60% identik dalam urutan asam aminonya, sementara lisozim ayam terdiri dari 129 residu asam amino (14,3 kDa), lisozim manusia memiliki 130 (14,7 kDa). Putih telur ayam adalah sumber komersial utama lisozim [2,3]. large Lisozim putih telur ayam (HEWL) aktif dalam kisaran pH (6 - 9) dan mewakili Suhu Leleh dan EntalpiEntalpi fusi suatu zat, juga dikenal sebagai panas laten, adalah ukuran masukan energi, biasanya panas, yang diperlukan untuk mengubah suatu zat dari padat menjadi cair. Titik leleh suatu zat adalah suhu saat zat tersebut berubah wujud dari padat (kristal) menjadi cair (lelehan isotropik). suhu leleh/transisi, Tm, 72 ° C pada pH 5,0 [4].
DSC sebagian besar diterapkan untuk mempelajari Stabilitas TermalSuatu bahan dikatakan stabil secara termal jika tidak terurai di bawah pengaruh suhu. Salah satu cara untuk menentukan stabilitas termal suatu zat adalah dengan menggunakan TGA (penganalisis termogravimetri). stabilitas termal protein dan formulasi protein. Meleburnya protein merupakan efek EndotermikTransisi sampel atau reaksi bersifat endotermik jika panas diperlukan untuk konversi.endotermik yang dihasilkan dari paparan gugus hidrofobiknya terhadap air medium. Oleh karena itu, untuk protein dalam larutan, puncak Proses PenyerapanPenyerapan adalah proses fisika dan kimia di mana suatu zat (biasanya gas atau cairan) terakumulasi di dalam fase lain atau pada batas fase dua fase. Tergantung pada tempat akumulasi, ada perbedaan antara absorpsi (akumulasi dalam fase) dan adsorpsi (akumulasi pada batas fase).penyerapan panas sering diamati dalam kurva DSC, dan puncak maksimumnya disebut dalam literatur sebagai Suhu Leleh dan EntalpiEntalpi fusi suatu zat, juga dikenal sebagai panas laten, adalah ukuran masukan energi, biasanya panas, yang diperlukan untuk mengubah suatu zat dari padat menjadi cair. Titik leleh suatu zat adalah suhu saat zat tersebut berubah wujud dari padat (kristal) menjadi cair (lelehan isotropik). suhu leleh / transisi (Tm). Ionic Denaturasi termal (Reaksi penguraianReaksi penguraian adalah reaksi yang diinduksi secara termal dari senyawa kimia yang membentuk produk padat dan/atau gas. penguraian struktur 3 dimensi protein) dapat bersifat reversibel atau ireversibel, tergantung pada karakteristik protein dan pada kondisi medium, gambar 2 [5]. Medium kondisi yang mempengaruhi reversibilitas denaturasi meliputi, misalnya, konsentrasi protein, pH, kekuatan, dan suhu. Oleh karena itu, diharapkan bahwa perubahan dalam struktur protein atau dalam formulasi medium dapat mempengaruhi termostabilitas protein, yang tercermin dalam Tm yang diukur.
DSC mengukur secara langsung Proses PenyerapanPenyerapan adalah proses fisika dan kimia di mana suatu zat (biasanya gas atau cairan) terakumulasi di dalam fase lain atau pada batas fase dua fase. Tergantung pada tempat akumulasi, ada perbedaan antara absorpsi (akumulasi dalam fase) dan adsorpsi (akumulasi pada batas fase).penyerapan panas yang terkait dengan proses yang sedang berlangsung. Ini adalah metode yang dapat diandalkan untuk menentukan karakteristik termodinamika protein asli untuk mengkarakterisasi protein yang mengalami modifikasi struktural atau untuk mengakses Stabilitas TermalSuatu bahan dikatakan stabil secara termal jika tidak terurai di bawah pengaruh suhu. Salah satu cara untuk menentukan stabilitas termal suatu zat adalah dengan menggunakan TGA (penganalisis termogravimetri). stabilitas termal formulasi protein untuk penggunaan terapeutik.
Eksperimental
Metode Persiapan Sampel
Lisozim1 dilarutkan dalam air suling dan air saring2 dengan konsentrasi 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml, dan 5 mg/ml. sebanyak 20 μl dari setiap konsentrasi dipipet ke dalam cawan lebur Concavus® yang segera ditutup rapat. Untuk larutan 24 mg/ml, volume 5 μl juga dianalisis. Setidaknya tiga pengukuran pada setiap sampel dilakukan. Wadah referensi diisi dengan volume yang sama dari air suling yang disaring. Pengukuran dilakukan di bawah atmosfer lembam (N2 dinamis, 40 ml/menit) dengan laju pemanasan 10 K/menit.
1 Lisozim putih telur ayam, ≥ 45.000 FIP U/mg, terliofilisasi, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polieter sulfon - filter membran PES, 450 μm
3 Concavus® 40 μl krusibel aluminium, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Hasil Pengukuran dan Diskusi
Kurva DSC dari larutan berair lisozim menunjukkan efek EndotermikTransisi sampel atau reaksi bersifat endotermik jika panas diperlukan untuk konversi.endotermik tunggal yang khas pada kisaran 75°C untuk semua konsentrasi yang diukur. Gambar 3 menggambarkan kurva tipikal larutan pada konsentrasi 300, 200 dan 20 mg/ml. Suhu awal yang diekstrapolasi, suhu puncak (Tm) dan area di bawah kurva (entalpi) bervariasi dengan konsentrasi. Semakin tinggi massa sampel dalam wadah, semakin luas efek endotermiknya. Efek perluasan diamati selama variasi onset dan suhu puncak yang diekstrapolasi serta entalpi. Konsentrasi yang dipilih mewakili obat protein terapeutik biasa, yang biasanya sangat pekat, dengan dosis protein yang diberikan dalam mg/kg berat badan. Gambar 4 menunjukkan pengaruh volume sampel dengan menampilkan kurva DSC larutan pada 20 mg/ml (5 μl) dan 5 mg/ml (20 μl).
Massa masing-masing adalah 0,13 mg dan 0,10 mg. Hasil dari semua pengukuran dirangkum dalam tabel 1.
Tabel 1: Karakterisasi lisozim dengan menggunakan DSC: konsentrasi, massa protein, volume sampel yang diukur dan masing-masing suhu transisi (puncak) dan entalpi (area)
Konsentrasi (mg/ml) | Volume Sampel (μl) | Konsentrasi (mM) | Massa Protein (mg) | Area (J/g) | Puncak (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Ringkasan
Dalam penelitian ini, DSC 300 Caliris® digunakan untuk menyelidiki suhu transisi lisozim dalam berbagai konsentrasi, dari 5 hingga 300 mg/ml, yang mewakili formulasi protein yang tersedia secara komersial. Meskipun larutan konsentrasi tinggi digunakan, pengukuran pada volume seperti small sebagai 5 μl memungkinkan untuk menghemat formulasi yang mahal dengan kemampuan reproduksi yang tinggi.
Sensitivitas sensor dan kemungkinan menggunakan small volume dalam kisaran beberapa mikroliter, bersama dengan kemungkinan memiliki pengubah sampel otomatis, membuat DSC menjadi teknik yang berharga untuk analisis biomolekul. Tergantung pada laju pemanasan/pendinginan, throughput dapat mencapai 3 sampel per jam.