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DSC를 통한 생체 분자 특성 분석: 리소자임

소개

리소자임 또는 뮤라미다제는 당과 아미노산으로 구성된 구조적 거대 분자인 펩티도글리칸을 가수분해하여 박테리아 세포의 외벽에 보호막을 형성하는 효소 그룹의 이름입니다. 리소자임은 자연계에 널리 퍼져 있으며 동물, 식물, 박테리아, 박테리오파지 바이러스에도 존재합니다. 리소자임은 박테리아 감염에 대항하는 선천 면역 체계의 일부입니다. 침이나 눈물 같은 신체 분비물, 조직, 장기에서도 발견할 수 있습니다. 항균 및 항진균 활성으로 인해 리소자임은 임상, 사료 및 식품 분야에서 잠재력을 가지고 있습니다[2]. 또한 여러 연구 분야에서 단백질 구조, 안정성 및 기능을 연구하기 위한 모델 분자로도 널리 활용되고 있습니다[3].

리소자임은 small 구형 단백질로, 다양한 생명체에서 유사한 화학 구조를 가지고 있습니다(그림 1 참조). 다양한 유형의 리소자임은 닭형, 거위형, 무척추동물형의 세 가지 주요 계열로 분류됩니다. 인간과 닭 리소자임은 닭형으로 분류되며 아미노산 서열이 거의 60% 동일하지만, 닭 리소자임은 129개의 아미노산 잔기(14.3 kDa)로 구성되어 있고, 인간 리소자임은 130개(14.7 kDa)로 구성되어 있습니다. 닭고기 달걀 흰자는 리소자임의 주요 상업적 공급원입니다[2,3]. 소위 암탉 난백 리소자임(HEWL)은 large 범위의 pH(6 - 9)에서 활성이며, pH 5.0에서 72°C의 용융/전이 온도(Tm)를 나타냅니다[4].

DSC는 주로 단백질 및 단백질 제제의 열 안정성을 연구하는 데 적용됩니다. 단백질이 접히는 것은 소수성 그룹이 수용액에 노출되어 발생하는 흡열 효과입니다 medium. 따라서 용액에 있는 단백질의 경우 DSC 곡선에서 열 흡수 피크가 관찰되는 경우가 많으며, 그 최대 피크는 문헌에서 용융/전이 온도(Tm)로 언급됩니다. 열 변성(단백질의 3차원 구조가 펼쳐짐)은 단백질의 특성과 medium, 그림 2 [5]의 조건에 따라 가역적 또는 비가역적일 수 있습니다. Medium 변성의 가역성에 영향을 미치는 조건에는 예를 들어 단백질 농도, pH, Ionic 강도 및 온도 등이 있습니다. 따라서 단백질 구조 또는 제형 medium 의 변화가 단백질의 열 안정성에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 측정된 Tm에 반영될 것으로 예상됩니다.

DSC는 전개 과정과 관련된 열 흡수를 직접 측정합니다. 이는 구조적 변형을 거친 단백질을 특성화하거나 치료용 단백질 제제의 열 안정성에 접근하기 위해 네이티브 단백질의 열역학적 특성을 결정하는 신뢰할 수 있는 방법입니다.

1) 암탉 난백 리소자임의 3D 구조 [1].
2) 단백질의 변성 및 재변성의 개략적인 예시.

실험적

시료 준비 방법

리소자임1을 증류수 및 여과수2에 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml, 5 mg/ml 농도로 용해시켰습니다. 각 농도의 20μl를 Concavus® 도가니3에 피펫팅하여 즉시 밀봉했습니다. 24 mg/ml 용액의 경우, 5 μl의 용액도 분석했습니다. 각 샘플에 대해 최소 3회 이상 측정이 수행되었습니다. 기준 도가니에는 동일한 부피의 증류 여과수를 채웠습니다. 측정은 불활성 분위기(동적 N2, 40ml/min)에서 10K/min의 가열 속도로 수행되었습니다.

1 달걀 흰자 리소자임, ≥ 45,000 FIP U/mg, 동결건조, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 폴리에테르 설폰 - PES 멤브레인 필터, 450 μm
3 Concavus® 40 μl 알루미늄 도가니, NETZSCH-Gerätebau GmbH

측정 결과 및 논의

리소자임 수용액의 DSC 곡선은 측정된 모든 농도에 대해 75°C 범위에서 전형적인 단일 흡열 효과를 보여줍니다. 그림 3은 300, 200 및 20 mg/ml 농도의 용액에 대한 일반적인 곡선을 보여줍니다. 추정된 시작 온도, 피크 온도(Tm) 및 곡선 아래 면적(엔탈피)은 농도에 따라 달라집니다. 도가니의 질량 샘플이 높을수록 흡열 효과는 더 넓어집니다. 확장 효과는 엔탈피뿐만 아니라 추정된 시작 및 최고 온도가 변화하는 동안 관찰됩니다. 선택된 농도는 일반적으로 고농도로 사용되는 일반적인 치료용 단백질 약물을 대표하며, 단백질 투여량은 체중의 mg/kg 단위로 제공됩니다. 그림 4는 20 mg/ml(5 μl)와 5 mg/ml(20 μl)에서의 용액의 DSC 곡선을 표시하여 시료 부피의 영향을 보여줍니다.

각각의 질량은 0.13mg 및 0.10mg이었습니다. 모든 측정 결과는 표 1에 요약되어 있습니다.

3) 리소자임 300 mg/ml(파란색 곡선), 200 mg/ml(녹색 곡선), 20 mg/ml(보라색 곡선)에서의 DSC 측정. 샘플 양: 20 μl.
4) 리소자임 20 mg/ml(보라색 곡선), 5 mg/ml(하늘색 곡선)에서의 DSC 측정. 샘플 양: 각각 5μl 및 20μl.

표 1: DSC를 통한 리소자임의 특성 분석: 농도, 단백질 질량, 측정 시료의 부피 및 각각의 전이 온도(피크) 및 엔탈피(면적)

농도

(mg/ml)

시료 부피

(μl)

농도

(mM)

단백질 질량

(mg)

면적

(J/g)

Peak

(°C)

3002021.46.37 ± 0.347.41 ± 0.1273.0 ± 0.2
2002014.34.26 ± 0.143.56 ± 0.1476.2 ± 0.4
20201.70.51 ± 0.00.69 ± 0.0577.4 ± 0.5
2051.70.10 ± 0.00.78 ± 0.1176.6 ± 0.2
5200.360.10 ± 0.00.33 ± 0.1979.3 ± 0.5

요약

이 연구에서는 시중에서 판매되는 단백질 제제의 대표적 농도인 5 ~ 300 mg/ml의 광범위한 농도에서 리소자임의 전이 온도를 조사하기 위해 DSC 300 Caliris® 을 사용했습니다. 고농도 용액을 사용했지만, 5μl의 small 용량으로 측정하여 고가의 제형을 높은 재현성으로 절약할 수 있었습니다.

센서 감도와 수 마이크로리터 범위의 small 부피를 사용할 수 있는 가능성, 자동화된 시료 주입기를 사용할 수 있는 가능성으로 인해 DSC는 생체 분자 분석에 유용한 기술입니다. 가열/냉각 속도에 따라 처리량은 시간당 3개의 샘플까지 가능합니다.

Literature

  1. [1]
    암탉의 난백 리소자임 구조의 실제 공간 개선 (2024년 6월),https://www.rcsb.org/structure/2lyz
  2. [2]
    페라보스키, P. 외 (2021). 선천성 면역 방어 인자 인 라이소자임의 대체 항생제로서의 응용. In 항생제 (10 권, 12 호). MDPI. doi.org/10.3390/antibiotics10121534
  3. [3]
    Rajaram S. 외, 라이소자임: 아밀로이드 연구용 모델 단백질, 편집자: Rossen Donev, 단백질 화학 및 구조 생물학의 발전, Academic Press, Volume 84, 2011, 63-111페이지, ISSN 1876-1623, ISBN 9780123864833.
  4. [4]
    벤카타라마니, S. 외(2013). 다양한 pH에서 고농도 리소자임의 열 안정성: 푸리에 변환 적외선 연구. 약학 및 바이오 연합 과학 저널, 5(2), 148-153. 도이:10.4103/0975-7406.111821
  5. [5]
    Johnson, C. M. (2013). 단백질 폴딩 및 안정성을위한 도구로서의 시차 주사 열량 측정. 생화학 및 생물 물리학 기록 보관소 (Vol. 531, 1-2 호, 100-109 쪽). 아카데믹 프레스 도이:10.1016/j.abb.2012.09.008.