Εισαγωγή
Purity Determination αποτελεί βασικό μέτρο ελέγχου ποιότητας που διασφαλίζει ότι μια ουσία είναι ασφαλής, αξιόπιστη και κατάλληλη για την προβλεπόμενη χρήση της. Επιβεβαιώνει την ταυτότητα και την ποιότητα της επιθυμητής ένωσης μετά την απομόνωση, τη σύνθεση ή την παραγωγή της και επαληθεύει ότι δεν περιέχει σημαντικές ακαθαρσίες, όπως πρώτες ύλες που δεν έχουν αντιδράσει, παραπροϊόντα και μολυσματικά στοιχεία. Η ανάλυση αυτή συμβάλλει στην αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας μιας διαδικασίας σύνθεσης ή παραγωγής, υποδεικνύει εάν απαιτείται περαιτέρω καθαρισμός και διασφαλίζει τη συνέπεια μεταξύ των παρτίδων παραγωγής.
Εάν μια ουσία προορίζεται για θεραπευτικές εφαρμογές, η ανάλυση καθαρότητας ( Purity Determination ) αποκτά ακόμη μεγαλύτερη σημασία. Η καθαρότητα των δραστικών φαρμακευτικών συστατικών είναι κρίσιμη για την καταλληλότητά τους προς φαρμακευτική χρήση. Οι ακαθαρσίες μπορούν να προκαλέσουν τοξικές επιδράσεις ή να θέσουν σε κίνδυνο τη σταθερότητα και τη βιοδιαθεσιμότητα του δραστικού φαρμακευτικού συστατικού (API) κατά τη διάρκεια της παρασκευής και της επεξεργασίας. Από την άποψη της διασφάλισης ποιότητας, αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα αναλυτικά πρότυπα, τα οποία χρησιμοποιούνται ως υλικά αναφοράς για την ανάπτυξη μεθόδων, τη βαθμονόμηση και τον τακτικό έλεγχο.
Ευτηκτικές προσμείξεις
Μια προσμείξη μπορεί να σχηματίσει ένα ευτηκτικό σύστημα με μια ουσία, εάν είναι διαλυτή στην υγρή φάση αλλά αδιάλυτη στη στερεή φάση. Στη διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC), τέτοιες προσμείξεις μπορούν να επηρεάσουν τη συμπεριφορά τήξης του υλικού, μειώνοντας τη θερμοκρασία τήξης που παρατηρείται και διευρύνοντας την ενδοθερμική καμπύλη τήξης καθώς αυξάνεται η περιεκτικότητα σε προσμείξεις. Αυτή η μείωση του σημείου τήξης αποτελεί τη βάση της μέθοδος « Purity Determination » σύμφωνα με τη θεωρία του van’t Hoff [3]. Οι ευτηκτικές προσμείξεις είναι επομένως ιδιαίτερα κρίσιμες, καθώς επηρεάζουν τη συμπεριφορά τήξης και παρεμποδίζουν την επεξεργασιμότητα. Ως εκ τούτου, η ταχεία θερμική ανάλυση καθαρότητας είναι απαραίτητη για τον ποιοτικό έλεγχο [4].
Με την ανάλυση της έναρξης της κορυφής τήξης ως συνάρτηση του ποσοστού τήξης, η καθαρότητα μιας ουσίας μπορεί να εκτιμηθεί χρησιμοποιώντας την εξίσωση του van’t Hoff (Εξ. 1), όπως περιγράφεται στη μέθοδο Α του προτύπου ASTM E928 [5]. Η εξίσωση αυτή συσχετίζει τον βαθμό μείωσης του σημείου τήξης με τη συγκέντρωση των ευτηκτικών προσμείξεων.
Όπου:
TS: θερμοκρασία δείγματος [K]
T0: θερμοκρασία τήξης της καθαρής ουσίας [K]
R: σταθερά των αερίων (= 8,314 J/mol-1·K-1)
x: μοριακό κλάσμα της προσμείξεως
Hf: θερμότητα τήξης [J·mol-1], υπολογισμένη από την επιφάνεια της κορυφής
F: κλάσμα που έχει λιώσει
Για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης των προσμείξεων σε ένα δείγμα, είναι απαραίτητο να πληρούνται ορισμένες προϋποθέσεις:
- Η ουσία πρέπει να είναι κρυσταλλική. ∙ Η ουσία και η προσμείξη δεν πρέπει να σχηματίζουν στερεά διαλύματα· δηλαδή, δεν αναμειγνύονται στη στερεά φάση.
- Η ουσία σχηματίζει ευτηκτικό σύστημα με την προσμείξη· αυτό σημαίνει ότι η ουσία και η προσμείξη σχηματίζουν ένα ομοιογενές μίγμα που τήκεται και στερεοποιείται όπως μια καθαρή ουσία.
- Οι ενώσεις που παρουσιάζουν πολυμορφισμό πρέπει να μετατραπούν πλήρως σε έναν μόνο πολυμορφισμό.
- Η ουσία δεν πρέπει να αποικοδομηθεί κατά τη διάρκεια της τήξης.
Η διαδικασία προσδιορισμού της καθαρότητας με DSC περιγράφεται στο USP <891>, στο Ph. Eur. 2.2.34, καθώς και σε διάφορα άλλα πρότυπα, όπως τα ASTM E928 και DIN 51007 [3,6].
Συγκεκριμένα, το πρότυπο ASTM E928 [5] περιγράφει και τυποποιεί τα κριτήρια απόδοσης ειδικά για τη μέθοδο DSC όσον αφορά υλικά υψηλής καθαρότητας (συγκέντρωση >98,5 mol-%, c <20%, απόκλιση <0,5 mol-% έναντι των μεθόδων αναφοράς) και καθορίζει τις συγκεκριμένες συνθήκες υπό τις οποίες πρέπει να πραγματοποιούνται οι μετρήσεις DSC.
Η καρβαμαζεπίνη (CBZ) είναι ένα συνθετικό αντισπασμωδικό που ανακαλύφθηκε το 1953 από τον Όμιλο Novartis και διατίθεται στο εμπόριο από το 1962 (εικόνα 1). Η καθαρή ουσία είναι μια λευκή, κρυσταλλική και πολυμορφική σκόνη (μορφές I–IV, διένυδρο) με εύρος τήξης 191–192 °C (μορφή I) και μοριακή μάζα 236,27 g/mol. Ο μηχανισμός δράσης της CBZ βασίζεται στην αναστολή των διαύλων Na+ που ενεργοποιούνται από τάση. Η κύρια φαρμακευτική της χρήση είναι στη θεραπεία της επιληψίας, της νευραλγίας του τριδύμου νεύρου και των διπολικών διαταραχών. Ωστόσο, η CBZ μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί κατά τη διάρκεια της αποχής από το αλκοόλ ή για τη θεραπεία του νευροπαθητικού πόνου [7,8].
Στην παρούσα μελέτη, εφαρμόσαμε το διάγραμμα van’t Hoff για τον προσδιορισμό της ποσότητας των προσμείξεων σε δύο αναλυτικά πρότυπα καρβαμαζεπίνης με διαφορετικές καθαρότητες, όπως προσδιορίστηκαν με HPLC. Σύμφωνα με το πρότυπο ASTM E928, αξιολογήσαμε την εφαρμοσιμότητα και την αξιοπιστία της μεθόδου DSC για Identify small τις διαφορές στην καθαρότητα τέτοιων υλικών αναφοράς.
Πειραματικό
Για το προϊόν « Purity Determination » της εταιρείας DSC, επιλέχθηκαν δύο διαφορετικά (δευτερεύοντα) αναλυτικά πρότυπα της ίδιας δραστικής φαρμακευτικής ουσίας, της καρβαμαζεπίνης (CBZ). Και τα δύο προϊόντα κατασκευάστηκαν από την Sigma-Aldrich (Merck KGaA) και πληρούσαν τις προδιαγραφές του κατασκευαστή που παρουσιάζονται στον πίνακα 1.
Πίνακας 1: Σύγκριση των προδιαγραφών των κατασκευαστών για τις δύο μορφές καρβαμαζεπίνης [1,2]
| Παράμετρος | Καρβαμαζεπίνη (CBZ-I) | Καρβαμαζεπίνη (CBZ-II) |
|---|---|---|
| Αριθμός προϊόντος | 94496 | C4024 |
| Παρτίδα | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL Καθαρότητα | 99,9% (Προδιαγραφές: ≥ 99,0%) | 99% (Προδιαγραφές: ≥ 98,0%) |
| Εμφάνιση | Λευκή σκόνη | Λευκή σκόνη |
| Σημείο τήξης | 191 έως 192 °C | 191 έως 192 °C |
Η ανάλυση HPLC του κατασκευαστή έδειξε διαφορά 0,9% στην καθαρότητα μεταξύ των δύο δειγμάτων CBZ.
Αυτή η διαφορά στην καθαρότητα μπορεί να επικυρωθεί θερμικά χρησιμοποιώντας μετρήσεις Διαφορικής Θερμιδομετρίας Σάρωσης (DSC) (NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme ) και τη λειτουργία « Purity Determination » του λογισμικού NETZSCH Proteus® 9.
Το NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme και το Proteus® λογισμικό επιτρέπει τον έλεγχο καθαρότητας DSC σύμφωνα με το πρότυπο ASTM ως ταχεία δοκιμή, κάτι που είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για την παρακολούθηση αναλυτικών προτύπων αναφοράς για τον έλεγχο ποιότητας.
Πρωτόκολλο μετρήσεων
Πριν από την ανάλυση με το DSC 300 της NETZSCH Caliris® Supreme , τα δοχεία αλουμινίου Concavus® καθαρίστηκαν με ισοπροπανόλη και υποβλήθηκαν σε θερμική προετοιμασία στους 425 °C για ένα λεπτό. Στη συνέχεια, τα δείγματα (~1,5 mg) τοποθετήθηκαν σε καθαρισμένα χωνευτήρια και σφραγίστηκαν ερμητικά.
Το πρόγραμμα θερμοκρασίας σχεδιάστηκε ώστε να ξεκινά πολύ κάτω από την αναμενόμενη έναρξη τήξης, προκειμένου να ληφθεί υπόψη η μείωση του σημείου τήξης που προκαλείται από τις ακαθαρσίες. Το πρωτόκολλο χρησιμοποίησε ένα προφίλ θέρμανσης δύο σταδίων: αρχική ταχεία θέρμανση, από 20 °C έως 160 °C με ρυθμό 20 K/min· ακολουθούμενη από αργή αύξηση της θερμοκρασίας με ρυθμό 0,7 K/min, από 160 °C έως 200 °C. Η μέτρηση πραγματοποιήθηκε υπό ατμόσφαιρα αζώτου με ροή καθαρισμού 40 ml/min, προκειμένου να διατηρηθεί αδρανής ατμόσφαιρα στο κελί καθ’ όλη τη διάρκεια του πειράματος.
Αποτελέσματα μετρήσεων
Το Σχήμα 2 παρουσιάζει τις καμπύλες DSC για τον πρώτο κύκλο θέρμανσης των CBZ-l και CBZ-ll. Οι εξωτεκμηριωμένες θερμοκρασίες έναρξης στα 190 °C για το CBZ-l: 190,2 °C / CBZ-ll: 190 °C συνάδουν με τις τιμές της βιβλιογραφίας για το CBZ, 190,2 °C σύμφωνα με τον Lide, D.R [9], αλλά στην περίπτωση του CBZ-l, είναι 0,2 °C υψηλότερη από εκείνη του CBZ-ll.
Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η παρουσία προσμείξεων στο δείγμα θα μειώσει το σημείο τήξης, διευρύνοντας την καμπύλη DSC. Με βάση την καμπύλη DSC, η λειτουργία καθαρότητας του λογισμικού υπολογίζει το διάγραμμα van't Hoff και παρέχει μια γραφική απεικόνιση των δεδομένων ανάλυσης καθαρότητας DSC· βλ. σχήμα 3. Απεικονίζει τη θερμοκρασία τήξης σε συνάρτηση με το αντίστροφο του κλάσματος τήξης (1/F), όπου το F αντιπροσωπεύει το τμήμα της συνολικής επιφάνειας της κορυφής τήξης.
Η καμπύλη συνήθως δεν είναι γραμμική, ενώ η μεγαλύτερη μη γραμμικότητα υποδηλώνει υψηλότερη περιεκτικότητα σε προσμίξεις. Αυτή η απόκλιση οφείλεται σε φαινόμενα που προηγούνται της τήξης και τα οποία δεν μπορούν να ανιχνευθούν με τη μέθοδο DSC. Επιπλέον, το πρόγραμμα μέτρησης και η ανάλυση των δεδομένων μπορούν επίσης να επηρεάσουν τη γραμμικότητα της καμπύλης. Για παράδειγμα, η έναρξη του τμήματος αύξησης της θερμοκρασίας με χαμηλό ρυθμό πολύ κοντά στην έναρξη της τήξης θα οδηγήσει σε λανθασμένη θερμοκρασία τήξης,TS. Ωστόσο, εάν έχετε επιλέξει σωστά το εύρος θερμοκρασίας, η λανθασμένη ρύθμιση της περιοχής της κορυφής θα επηρεάσει τα όρια ολοκλήρωσης της κορυφής, επηρεάζοντας τη θερμότητα τήξης που υπολογίζεται,Hf. Και οι δύο καταστάσεις θα επιδεινώσουν τη μη γραμμικότητα του διαγράμματος.
Για την επίτευξη γραμμικότητας, το λογισμικό ανάλυσης εφαρμόζει έναν συντελεστή διόρθωσης, c, ο οποίος προστίθεται αναλογικά τόσο στη συνολική επιφάνεια της κορυφής όσο και σε κάθε μερική επιφάνεια, F. Αυτή η επαναληπτική προσαρμογή αποδίδει μια διορθωμένη τιμή F που παράγει μια γραμμική σχέση στην εξίσωσηTS = f(1/F)
Εκτός από την καμπύλη DSC που έχει ληφθεί, η λειτουργία του λογισμικού « Purity Determination » απαιτεί το μοριακό βάρος της καθαρής ουσίας για την παροχή αποτελεσμάτων σε mole%. Η τελική καθαρότητα προσδιορίζεται από την κλίση των γραμμικοποιημένων δεδομένων, ενώ η παρέκταση στο 1/F = 0 παρέχει τη θεωρητική θερμοκρασία τήξης του 100% καθαρού υλικού. Τα αποτελέσματα είναι αξιόπιστα μόνο όταν τα προσαρμοσμένα δεδομένα παρουσιάζουν γραμμικότητα, το επίπεδο καθαρότητας είναι υψηλότερο από 98,5% και ο συντελεστής διόρθωσης, c, είναι χαμηλότερος από 20% [4].
Το θεωρητικό σημείο τήξης του 100% καθαρού CBZ ανέρχεται σε 190,425 °C για το CBZ-l και σε 190,411 °C για το CBZ-ll, σε σύγκριση με τη θερμοκρασία τήξης των 190,358 °C και 190,320 °C, αντίστοιχα. Η υπολογισμένη περιεκτικότητα σε προσμίξεις του μετρηθέντος δείγματος CBZ-l ήταν 0,098 mole% και για το CBZ-ll 0,135 mole%. Ο συντελεστής διόρθωσης και για τα δύο δείγματα είναι μικρότερος από 10%, 4,633% για το CBZ-l και 6,978% για το CBZ-ll, γεγονός που αποδεικνύει την υψηλή ποιότητα των δεδομένων και τη συμμόρφωση με το πρότυπο ASTM. Μετά τη μέτρηση, το δείγμα ζυγίστηκε εκ νέου και δεν διαπιστώθηκε καμία απώλεια μάζας. Αυτό επιβεβαιώνει ότι κατά τη διάρκεια της μέτρησης δεν συνέβη ούτε αποσύνθεση του δείγματος ούτε εξάτμιση, γεγονός που επίσης συμμορφώνεται με τη μέγιστη απώλεια βάρους 1% που ορίζεται στο πρότυπο ASTM.
Η καθαρότητα του CBZ-l (99,9% HPLC) είναι 99,902 mol%, ενώ εκείνη του CBZ-ll (99% HPLC) είναι 99,865 mol%. Η διαφορά του 0,037% θεωρείται οριακή αλλά στατιστικά σημαντική σύμφωνα με μια δίπλευρη δοκιμή t, αν και πρέπει να ληφθεί υπόψη ο περιορισμένος αριθμός επαναλήψεων (σχήμα 4). Η χαμηλότερη τιμή c του CBZ-l (4,8% έναντι 6,2%) υποδηλώνει μικρότερη προ-τήξη, η οποία μπορεί να οφείλεται σε υψηλότερο βαθμό καθαρότητας [6].
Τα παρόντα αποτελέσματα αντανακλούν τις προδιαγραφές του κατασκευαστή και, ως εκ τούτου, επιβεβαιώνουν την ευαισθησία και την αξιοπιστία αυτής της θερμοαναλυτικής μεθόδου. Η διαφορά στην καθαρότητα που προσδιορίστηκε με DSC, ύψους 0,037% (CBZ-l έναντι CBZ-ll), αντανακλά μόνο ευτηκτικές προσμείξεις, που είναι το είδος της προσμείξης που μπορεί να ανιχνεύσει η μέθοδος DSC. Η ανιχνευθείσα ακαθαρσία εμπίπτει στο εύρος της μεθόδου ASTM, < 1,5 mol%, και υπερβαίνει το ποσοτικό όριο ανίχνευσης του 0,001 mol%.
Συμπέρασμα
Η παρούσα μελέτη καταλήγει στο συμπέρασμα ότι το σύστημα ανίχνευσης ακαθαρσιών ( NETZSCH ) DSC 300 Caliris® Supreme , σε συνδυασμό με τη λειτουργία λογισμικού « Purity Determination » του NETZSCH Proteus® για το DSC, είναι ιδανικό για τον έλεγχο ακαθαρσιών που επηρεάζουν τη διαδικασία τήξης και, κατά συνέπεια, για τον προσδιορισμό της καθαρότητας πολυάριθμων φαρμακευτικών προϊόντων, συμπεριλαμβανομένης της διάκρισης μεταξύ βαθμών καθαρότητας διαφορετικών αναλυτικών προτύπων.
Ευχαριστίες
Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε θερμά τη Gabriele Kaiser και τον Δρ. Stefan Schmölzer για την πολύτιμη συμβολή τους στην τεχνική αξιολόγηση και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων.