Wprowadzenie
Purity Determination stanowi kluczowy środek kontroli jakości, mający na celu zapewnienie, że dana substancja jest bezpieczna, niezawodna i nadaje się do zamierzonego zastosowania. Potwierdza ona tożsamość i jakość pożądanego związku po jego wyizolowaniu, syntezie lub wytworzeniu oraz weryfikuje, czy jest on wolny od istotnych zanieczyszczeń, takich jak nieprzereagowane materiały wyjściowe, produkty uboczne i zanieczyszczenia. Analiza ta pomaga ocenić skuteczność procesu syntezy lub produkcji, wskazuje, czy konieczne jest dalsze oczyszczanie, oraz wspiera spójność między partiami produkcyjnymi.
Jeśli substancja jest przeznaczona do zastosowań terapeutycznych, analiza czystości ( Purity Determination ) nabiera jeszcze większego znaczenia. Czystość aktywnych składników farmaceutycznych ma kluczowe znaczenie dla ich przydatności do zastosowań farmaceutycznych. Zanieczyszczenia mogą powodować skutki toksyczne lub zagrażać stabilności i biodostępności aktywnego składnika farmaceutycznego (API) podczas przygotowywania preparatu i przetwarzania. Z punktu widzenia zapewnienia jakości ma to szczególne znaczenie w przypadku standardów analitycznych, które są wykorzystywane jako materiały referencyjne do opracowywania metod, kalibracji i rutynowej kontroli.
Zanieczyszczenia eutektyczne
Zanieczyszczenie może tworzyć układ eutektyczny z daną substancją, jeśli jest rozpuszczalne w fazie ciekłej, ale nierozpuszczalne w fazie stałej. W różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) takie zanieczyszczenia mogą wpływać na zachowanie materiału podczas topnienia, obniżając obserwowaną temperaturę topnienia i poszerzając endotermę topnienia wraz ze wzrostem zawartości zanieczyszczeń. To obniżenie temperatury topnienia stanowi podstawę metody „ Purity Determination ” zgodnie z teorią van’t Hoffa [3]. Zanieczyszczenia eutektyczne mają zatem szczególne znaczenie, ponieważ wpływają na zachowanie podczas topnienia i utrudniają przetwarzanie. Dlatego szybka analiza czystości termicznej ma zasadnicze znaczenie dla kontroli jakości [4].
Analizując początek piku topnienia w funkcji frakcji stopionej, można oszacować czystość substancji za pomocą równania van’t Hoffa (równanie 1), zgodnie z opisem w metodzie A normy ASTM E928 [5]. Równanie to łączy stopień obniżenia temperatury topnienia ze stężeniem zanieczyszczeń eutektycznych.
Gdzie:
TS: temperatura próbki [K]
T0: Temperatury i entalpie topnieniaEntalpia syntezy substancji, znana również jako ciepło utajone, jest miarą nakładu energii, zazwyczaj ciepła, która jest niezbędna do przekształcenia substancji ze stanu stałego w ciekły. Temperatura topnienia substancji to temperatura, w której zmienia ona stan ze stałego (krystalicznego) na ciekły (stopiony izotropowo).temperatura topnienia czystej substancji [K]
R: stała gazowa (= 8,314 J/mol⁻¹·K⁻¹)
x: ułamek molowy zanieczyszczenia
Hf: ciepło topnienia [J·mol⁻¹], obliczone na podstawie pola piku
F: ułamek stopiony
W celu określenia stężenia zanieczyszczenia w próbce należy spełnić kilka warunków:
- Substancja musi być krystaliczna. ∙ Substancja i zanieczyszczenie nie mogą tworzyć roztworów stałych, to znaczy nie mogą się mieszać w fazie stałej.
- Substancja tworzy z zanieczyszczeniem układ eutektyczny; oznacza to, że substancja i zanieczyszczenie tworzą jednorodną mieszaninę, która topi się i krzepnie jak substancja czysta.
- Związki wykazujące PolimorfizmPolimorfizm to zdolność materiału stałego do tworzenia różnych struktur krystalicznych (synonimy: formy, modyfikacje).polimorfizm muszą zostać całkowicie przekształcone w jeden polimorf.
- Substancja nie może ulegać degradacji podczas topnienia.
Procedura określania czystości metodą DSC została opisana w USP <891>, Ph. Eur. 2.2.34 oraz w różnych innych normach, takich jak ASTM E928 i DIN 51007 [3,6].
W szczególności norma ASTM E928 [5] opisuje i standaryzuje kryteria wydajności specyficzne dla DSC w odniesieniu do materiałów o wysokiej czystości (stężenie >98,5 mol-%, c <20%, odchylenie <0,5 mol-% w stosunku do metod referencyjnych) oraz określa konkretne warunki, w jakich należy przeprowadzać pomiary metodą DSC.
Karbamazepina (CBZ) jest syntetycznym lekiem przeciwdrgawkowym, odkrytym w 1953 r. przez grupę Novartis i dostępnym na rynku od 1962 r. (rysunek 1). Czysta substancja jest białym, krystalicznym i polimorficznym proszkiem (formy I–IV, dihydrat) o zakresie temperatur topnienia 191–192°C (forma I) i masie molowej 236,27 g/mol. Mechanizm działania CBZ opiera się na hamowaniu napięciowo-zależnych kanałów sodowych (Na+). Jego głównym zastosowaniem farmaceutycznym jest leczenie padaczki, neuralgii nerwu trójdzielnego oraz zaburzeń afektywnych dwubiegunowych. Jednak CBZ może być również stosowany podczas odstawiania alkoholu lub w leczeniu bólu neuropatycznego [7,8].
W niniejszym badaniu zastosowaliśmy wykres van’t Hoffa w celu określenia ilości zanieczyszczeń w dwóch analitycznych wzorcach karbamazepiny o różnej czystości określonej metodą HPLC. Zgodnie z normą ASTM E928 oceniliśmy przydatność i wiarygodność metody DSC w odniesieniu do różnic w czystości takich materiałów referencyjnych określonych metodą Identify small .
Eksperymentalne
W przypadku zestawu testowego „ Purity Determination ” firmy DSC wybrano dwa różne (wtórne) wzorce analityczne tego samego aktywnego składnika farmaceutycznego, karbamazepiny (CBZ). Oba produkty zostały wyprodukowane przez firmę Sigma-Aldrich (Merck KGaA) i spełniały specyfikacje producenta przedstawione w tabeli 1.
Tabela 1: Porównanie specyfikacji producentów dotyczących dwóch gatunków karbamazepiny [1,2]
| Parametr | Karbamazepina (CBZ-I) | Karbamazepina (CBZ-II) |
|---|---|---|
| Numer produktu | 94496 | C4024 |
| Partia | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL Czystość | 99,9% (specyfikacja: ≥ 99,0%) | 99% (specyfikacja: ≥ 98,0%) |
| Wygląd | Biały proszek | Biały proszek |
| Temperatura topnienia | od 191 do 192°C | od 191 do 192 °C |
Analiza HPLC przeprowadzona przez producenta wykazała różnicę w czystości wynoszącą 0,9% między dwiema próbkami CBZ.
Tę różnicę w czystości można zweryfikować termicznie za pomocą pomiarów metodą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) (NETZSCH DSC 300 Caliris®Supreme ) oraz funkcji „ Purity Determination ” oprogramowania NETZSCH Proteus® 9.
NETZSCH DSC 300 Caliris®Supreme oraz oprogramowanie Proteus® umożliwiają przeprowadzanie zgodnych z normą ASTM badań przesiewowych czystości metodą DSC w formie szybkiego testu, co jest szczególnie cenne w monitorowaniu analitycznych wzorców odniesienia w ramach kontroli jakości.
Protokół pomiarowy
Przed przeprowadzeniem analizy za pomocą urządzenia DSC 300 firmy NETZSCH Caliris®Supreme aluminiowe Concavus® naczynia zostały oczyszczone w izopropanolu i poddane kondycjonowaniu termicznemu w temperaturze 425°C przez jedną minutę. Następnie próbki (~1,5 mg) umieszczono w oczyszczonych tyglach i hermetycznie zamknięto.
Program temperaturowy został zaprojektowany tak, aby rozpoczynał się znacznie poniżej przewidywanej temperatury początku topnienia, co miało na celu uwzględnienie obniżenia temperatury topnienia spowodowanego zanieczyszczeniami. W protokole zastosowano dwuetapowy profil ogrzewania: początkowe szybkie ogrzewanie od 20°C do 160°C z prędkością 20 K/min; a następnie powolny wzrost temperatury z prędkością 0,7 K/min, od 160°C do 200°C. Pomiar przeprowadzono w atmosferze azotu przy przepływie przedmuchiwania wynoszącym 40 ml/min, aby utrzymać atmosferę obojętną w komórce przez cały czas trwania eksperymentu.
Wyniki pomiarów
Na rysunku 2 przedstawiono krzywe DSC dla pierwszego cyklu ogrzewania próbek CBZ-l i CBZ-ll. Ekstrapolowane temperatury początku przemiany wynoszące 190°C dla CBZ-l: 190,2°C / CBZ-ll: 190°C są zgodne z wartościami podanymi w literaturze dla CBZ, tj. 190,2°C według Lide’a, D.R [9], jednak w przypadku CBZ-l jest ona o 0,2°C wyższa niż w przypadku CBZ-ll.
Jak wspomniano wcześniej, zanieczyszczenia w próbce obniżają temperaturę topnienia, powodując poszerzenie krzywej DSC. Na podstawie krzywej DSC funkcja oprogramowania do analizy czystości oblicza wykres van't Hoffa i przedstawia graficzną reprezentację danych z analizy czystości DSC; patrz rysunek 3. Wykres przedstawia temperaturę topnienia w funkcji odwrotności frakcji stopionej (1/F), gdzie F oznacza część całkowitej powierzchni piku topnienia.
Wykres zazwyczaj nie ma charakteru liniowego, przy czym większa nieliniowość wskazuje na wyższą zawartość zanieczyszczeń. Odchylenie to wynika z efektów występujących przed topnieniem, których nie można wykryć za pomocą DSC. Ponadto na liniowość wykresu mogą również wpływać program pomiarowy oraz analiza danych. Na przykład rozpoczęcie odcinka wzrostu temperatury o niskiej szybkości zbyt blisko początku topnienia spowoduje uzyskanie błędnej temperatury topnienia,TS. Jeśli jednak zakres temperatur został dobrze dobrany, nieprawidłowe ustawienie pola piku zakłóci granice integracji piku, wpływając na obliczoną ciepło topnienia,Hf. Obie sytuacje pogłębią nieliniowość wykresu.
Aby uzyskać liniowość, oprogramowanie analityczne stosuje współczynnik korekcyjny c, który jest dodawany proporcjonalnie zarówno do całkowitej powierzchni piku, jak i do każdej powierzchni ułamkowej F. Ta iteracyjna korekta daje skorygowaną wartość F, która zapewnia liniową zależność w równaniuTS = f(1/F)
Oprócz uzyskanej krzywej DSC funkcja oprogramowania „ Purity Determination ” wymaga podania masy cząsteczkowej czystej substancji, aby uzyskać wyniki w % molowych. Ostateczną czystość określa się na podstawie nachylenia zlinearyzowanych danych, natomiast ekstrapolacja do wartości 1/F = 0 pozwala uzyskać teoretyczną temperaturę topnienia materiału o czystości 100%. Wyniki są wiarygodne tylko wtedy, gdy skorygowane dane wykazują liniowość, poziom czystości jest wyższy niż 98,5%, a współczynnik korekcyjny c jest niższy niż 20% [4].
Teoretyczna Temperatury i entalpie topnieniaEntalpia syntezy substancji, znana również jako ciepło utajone, jest miarą nakładu energii, zazwyczaj ciepła, która jest niezbędna do przekształcenia substancji ze stanu stałego w ciekły. Temperatura topnienia substancji to temperatura, w której zmienia ona stan ze stałego (krystalicznego) na ciekły (stopiony izotropowo).temperatura topnienia CBZ o czystości 100% wynosi 190,425°C dla CBZ-l oraz 190,411°C dla CBZ-ll, w porównaniu z temperaturą topnienia wynoszącą odpowiednio 190,358°C i 190,320°C. Obliczona zawartość zanieczyszczeń w badanej próbce CBZ-l wyniosła 0,098% molowego, a dla CBZ-ll – 0,135% molowego. Współczynnik korekcyjny dla obu próbek wynosi mniej niż 10%: 4,633% dla CBZ-l i 6,978% dla CBZ-ll, co świadczy o wysokiej jakości danych i zgodności z normą ASTM. Po zakończeniu pomiaru próbkę ponownie zważono i nie stwierdzono utraty masy. Potwierdza to, że podczas pomiaru nie doszło ani do rozkładu próbki, ani do jej ulatniania się, co jest również zgodne z maksymalną utratą masy wynoszącą 1%, określoną w normie ASTM.
Czystość CBZ-l (99,9% HPLC) wynosi 99,902 mol%, natomiast czystość CBZ-ll (99% HPLC) wynosi 99,865 mol%. Różnica wynosząca 0,037% jest uważana za marginalną, ale statystycznie istotną zgodnie z dwustronnym testem t, choć należy wziąć pod uwagę ograniczoną liczbę powtórzeń (rysunek 4). Niższa wartość c dla CBZ-l (4,8% w porównaniu z 6,2%) sugeruje mniejsze stopienie wstępne, co może wynikać z wyższego stopnia czystości [6].
Przedstawione wyniki są zgodne ze specyfikacjami producenta, co potwierdza czułość i wiarygodność tej metody termoanalitycznej. Różnica w czystości określonej metodą DSC wynosząca 0,037% (CBZ-l w porównaniu z CBZ-ll) odzwierciedla wyłącznie zanieczyszczenia eutektyczne, czyli rodzaj zanieczyszczeń, które metoda DSC jest w stanie wykryć. Wykryta zanieczyszczenie mieści się w zakresie określonym w metodzie ASTM (< 1,5 mol%) i przekracza ilościową granicę wykrywalności wynoszącą 0,001 mol%.
Wnioski
W niniejszym badaniu stwierdzono, że spektrometr DSC 300 firmy NETZSCH Caliris®Supreme w połączeniu z funkcją oprogramowania Purity Determination dostępną na stronie NETZSCH Proteus® przeznaczoną dla spektrometrów DSC doskonale nadaje się do wykrywania zanieczyszczeń wpływających na proces topnienia, a co za tym idzie – do określania czystości wielu preparatów farmaceutycznych, w tym do rozróżniania stopni czystości różnych wzorców analitycznych.
Podziękowania
Serdecznie dziękujemy Gabriele Kaiser oraz dr Stefanowi Schmölzerowi za ich cenny wkład w ocenę techniczną i interpretację wyników.