Úvod
Purity Determination je klíčovým opatřením v rámci kontroly kvality, které zajišťuje, že látka je bezpečná, spolehlivá a vhodná pro zamýšlené použití. Potvrzuje identitu a kvalitu požadované sloučeniny po izolaci, syntéze nebo výrobě a ověřuje, že neobsahuje významné nečistoty, jako jsou nezreagované výchozí látky, vedlejší produkty a kontaminanty. Tato analýza pomáhá vyhodnotit účinnost syntetického nebo výrobního procesu, ukazuje, zda je nutné další čištění, a podporuje konzistenci mezi jednotlivými výrobními šaržemi.
Je-li látka určena k terapeutickému použití, nabývá analýza čistoty ( Purity Determination ) ještě většího významu. Čistota účinných farmaceutických látek je rozhodující pro jejich vhodnost k farmaceutickému použití. Nečistoty mohou způsobit toxické účinky nebo ohrozit stabilitu a biologickou dostupnost účinné farmaceutické látky (API) během přípravy a zpracování. Z hlediska zajištění kvality je to zvláště důležité pro analytické standardy, které se používají jako referenční materiály pro vývoj metod, kalibraci a rutinní kontrolu.
Eutektické příměsi
Příměs může s látkou tvořit eutektický systém, pokud je rozpustná v kapalné fázi, ale nerozpustná v pevné fázi. Při diferenciální skenovací kalorimetrii (DSC) mohou takové příměsi ovlivňovat chování materiálu při tání tím, že s rostoucím obsahem příměsi snižují pozorovanou teplotu tání a rozšiřují endotermickou křivku tání. Toto snížení teploty tání je základem metody „ Purity Determination “ podle van’t Hoffovy teorie [3]. Eutektické nečistoty jsou proto obzvláště kritické, protože ovlivňují chování při tání a narušují zpracovatelnost. Rychlá termická analýza čistoty je proto nezbytná pro kontrolu kvality [4].
Analýzou nástupu vrcholu křivky tání v závislosti na podílu roztavené frakce lze odhadnout čistotu látky pomocí van’t Hoffovy rovnice (rov. 1), jak je popsáno v metodě A normy ASTM E928 [5]. Tato rovnice spojuje míru snížení bodu tání s koncentrací eutektických nečistot.
Kde:
TS: teplota vzorku [K]
T0: teplota tání čisté látky [K]
R: plynová konstanta (= 8,314 J/mol-1·K-1)
x: molární podíl nečistoty
Hf: teplo tání [J·mol-1], vypočítané z plochy píku
F: podíl roztavené látky
Pro stanovení koncentrace nečistot ve vzorku je nutné splnit několik podmínek:
- Látka musí být krystalická. ∙ Látka a nečistota nesmí tvořit pevné roztoky; to znamená, že se v pevné fázi nemísí.
- Látka tvoří s nečistotou eutektický systém; to znamená, že látka a nečistota tvoří homogenní směs, která taje a tuhne jako čistá látka.
- Sloučeniny vykazující PolymorfismusPolymorfismus je schopnost pevného materiálu vytvářet různé krystalické struktury (synonyma: formy, modifikace).polymorfismus musí být zcela přeměněny na jediný polymorf.
- Látka se nesmí během tavení rozkládat.
Postup pro stanovení čistoty metodou DSC je popsán v USP <891>, Ph. Eur. 2.2.34 a v různých dalších normách, jako jsou ASTM E928 a DIN 51007 [3,6].
Konkrétně norma ASTM E928 [5] popisuje a standardizuje výkonnostní kritéria specifická pro DSC u vysoce čistých materiálů (koncentrace >98,5 mol-%, c <20 %, odchylka <0,5 mol-% oproti referenčním metodám) a definuje konkrétní podmínky, za kterých musí být měření DSC prováděna.
Karbamazepin (CBZ) je syntetické antikonvulzivum, které bylo objeveno v roce 1953 skupinou Novartis a je komerčně dostupné od roku 1962 (obrázek 1). Čistá látka je bílý, krystalický a polymorfní prášek (formy I–IV, dihydrát) s rozmezím teplot tání 191–192 °C (forma I) a molární hmotností 236,27 g/mol. Mechanismus účinku CBZ spočívá v inhibici napěťově řízených Na+ kanálů. Jeho primární farmaceutické využití je v léčbě epilepsie, neuralgie trojklaného nervu a bipolárních poruch. CBZ lze však použít také při abstinenčních příznacích po vysazení alkoholu nebo k léčbě neuropatické bolesti [7,8].
V této studii jsme použili van’t Hoffův graf k určení množství nečistot ve dvou analytických standardech karbamazepinu s různou čistotou stanovenou metodou HPLC. V souladu s normou ASTM E928 jsme vyhodnotili použitelnost a spolehlivost metody DSC při Identify small rozdílech v čistotě těchto referenčních materiálů.
Experimentální
Pro studii „ Purity Determination “ provedenou společností DSC byly vybrány dva různé (sekundární) analytické standardy téže účinné farmaceutické látky, karbamazepinu (CBZ). Oba produkty byly vyrobeny společností Sigma-Aldrich (Merck KGaA) a splňovaly specifikace výrobce uvedené v tabulce 1.
Tabulka 1: Srovnání specifikací výrobců pro dvě jakosti karbamazepinu [1,2]
| Parametr | Karbamazepin (CBZ-I) | Karbamazepin (CBZ-II) |
|---|---|---|
| Číslo produktu | 94496 | C4024 |
| Šarže | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL Čistota | 99,9 % (specifikace: ≥ 99,0 %) | 99 % (specifikace: ≥ 98,0 %) |
| Vzhled | Bílý prášek | Bílý prášek |
| Teplota tání | 191 až 192 °C | 191 až 192 °C |
Analýza HPLC provedená výrobcem odhalila rozdíl v čistotě mezi oběma vzorky CBZ ve výši 0,9 %.
Tento rozdíl v čistotě lze tepelně ověřit pomocí měření diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC) (NETZSCH DSC 300 Caliris®Supreme ) a funkce „ Purity Determination “ softwaru NETZSCH Proteus® 9.
NETZSCH, DSC 300 Caliris®Supreme a software Proteus® umožňují provádět screening čistoty metodou DSC v souladu s normou ASTM formou rychlého testu, což je obzvláště užitečné pro monitorování analytických referenčních standardů v rámci kontroly kvality.
Protokol měření
Před analýzou pomocí přístroje DSC 300 od společnosti NETZSCH Caliris®Supreme byly hliníkové Concavus® nádoby očištěny v isopropanolu a tepelně kondicionovány při teplotě 425 °C po dobu jedné minuty. Vzorky (~1,5 mg) byly poté vloženy do očištěných kelímků a hermeticky uzavřeny.
Teplotní program byl navržen tak, aby se zahřívání zahájilo výrazně pod očekávaným počátkem tání, a to s ohledem na snížení bodu tání způsobené nečistotami. Protokol využíval dvoustupňový profil ohřevu: počáteční rychlý ohřev z 20 °C na 160 °C rychlostí 20 K/min; následovaný pomalým zvyšováním teploty rychlostí 0,7 K/min z 160 °C na 200 °C. Měření bylo prováděno v atmosféře dusíku při průtoku proplachovacího plynu 40 ml/min, aby byla v měřicí komůrce po celou dobu experimentu udržována inertní atmosféra.
Výsledky měření
Obrázek 2 znázorňuje DSC křivky pro první ohřívací cyklus vzorků CBZ-l a CBZ-ll. Extrapolované počáteční teploty při 190 °C pro CBZ-l: 190,2 °C / CBZ-ll: 190 °C odpovídají hodnotám uvedeným v literatuře pro CBZ, 190,2 °C podle Lide, D.R [9], avšak v případě CBZ-l je o 0,2 °C vyšší než u CBZ-ll.
Jak již bylo uvedeno, nečistoty ve vzorku snižují teplotu tání a rozšiřují DSC křivku. Na základě DSC křivky funkce softwaru pro analýzu čistoty vypočítá van't Hoffův graf a poskytne grafické znázornění dat z DSC analýzy čistoty; viz obrázek 3. Vykresluje teplotu tání v závislosti na reciproké hodnotě roztavené frakce (1/F), kde F představuje podíl na celkové ploše taveného píku.
Graf obvykle není lineární, přičemž větší nelinearita naznačuje vyšší množství nečistot. Tato odchylka vyplývá z jevů před roztavením, které nelze pomocí DSC detekovat. Linearitu grafu mohou navíc ovlivnit i měřicí program a analýza dat. Například pokud začnete segment s pomalým zvyšováním teploty příliš blízko začátku tání, získáte nesprávnou teplotu táníTS. Pokud jste však správně zvolili teplotní rozsah, nesprávné nastavení plochy píku naruší hranice integrace píku, což ovlivní vypočítané teplo táníHf. Obě situace zhorší nelinearitu grafu.
Pro dosažení linearity aplikuje analytický software korekční faktor c, který se připočítává proporcionálně jak k celkové ploše píku, tak ke každé dílčí ploše F. Tato iterativní korekce vede k opravené hodnotě F, která zajišťuje lineární vztah v rovniciTS = f(1/F)
Kromě naměřené DSC křivky vyžaduje funkce softwaru „ Purity Determination “ zadání molekulové hmotnosti čisté látky, aby bylo možné vypočítat výsledky v molových procentech. Konečná čistota se určuje na základě sklonu linearizovaných dat, zatímco extrapolace na 1/F = 0 poskytuje teoretickou teplotu tání 100% čistého materiálu. Výsledky jsou spolehlivé pouze tehdy, pokud upravená data vykazují linearitu, úroveň čistoty je vyšší než 98,5 % a korekční faktor c je nižší než 20 % [4].
Teoretický bod tání 100 % čistého CBZ činí 190,425 °C pro CBZ-l a 190,411 °C pro CBZ-ll, v porovnání s teplotou tání 190,358 °C, respektive 190,320 °C. Vypočtený obsah nečistot u měřeného vzorku CBZ-l činil 0,098 mol% a u vzorku CBZ-ll 0,135 mol%. Korekční faktor u obou vzorků je nižší než 10 %, konkrétně 4,633 % u vzorku CBZ-l a 6,978 % u vzorku CBZ-ll, což dokládá vysokou kvalitu dat a soulad s normou ASTM. Po měření byl vzorek znovu zvážen a nebyla zjištěna žádná ztráta hmotnosti. To potvrzuje, že během měření nedošlo ani k rozkladu vzorku, ani k jeho odpařování, což rovněž odpovídá maximální ztrátě hmotnosti 1 % stanovené v normě ASTM.
Čistota vzorku CBZ-l (99,9 % HPLC) činí 99,902 mol%, zatímco čistota vzorku CBZ-ll (99 % HPLC) činí 99,865 mol%. Rozdíl 0,037 % je považován za zanedbatelný, avšak podle dvoustranného t-testu je statisticky významný, i když je třeba vzít v úvahu omezený počet opakovaných měření (obrázek 4). Nižší hodnota c u vzorku CBZ-l (4,8 % oproti 6,2 %) naznačuje menší předtavení, což může být způsobeno vyšším stupněm čistoty [6].
Předložené výsledky odpovídají specifikacím výrobce, a potvrzují tak citlivost a spolehlivost této termoanalytické metody. Rozdíl v čistotě stanovené metodou DSC ve výši 0,037 % (CBZ-l vs. CBZ-ll) odráží pouze eutektické nečistoty, což je druh nečistot, které metoda DSC dokáže detekovat. Zjištěná nečistota spadá do rozsahu stanoveného metodou ASTM (< 1,5 mol. %) a překračuje kvantitativní detekční limit 0,001 mol.
Závěr
Tato studie dospěla k závěru, že přístroj DSC 300 od společnosti NETZSCH Caliris®Supreme v kombinaci s softwarovou funkcí Purity Determination na stránkách NETZSCH Proteus® pro DSC je ideální pro screening nečistot, které ovlivňují proces tání, a následně pro stanovení čistoty řady léčiv, včetně rozlišení mezi stupni čistoty různých analytických standardů.
Poděkování
Velké poděkování patří Gabriele Kaiserové a Dr. Stefanovi Schmölzerovi za jejich cenný přínos k technickému vyhodnocení a interpretaci výsledků.