Johdanto
Purity Determination on keskeinen laadunvalvontatoimenpide, jolla varmistetaan, että aine on turvallinen, luotettava ja sopiva aiottuun käyttötarkoitukseensa. Sen avulla vahvistetaan halutun yhdisteen identiteetti ja laatu eristämisen, synteesin tai tuotannon jälkeen sekä varmistetaan, ettei siinä ole merkittäviä epäpuhtauksia, kuten reagoimattomia lähtöaineita, sivutuotteita ja kontaminantteja. Tämä analyysi auttaa arvioimaan synteesi- tai tuotantoprosessin tehokkuutta, osoittaa, tarvitaanko lisäpuhdistusta, ja tukee tuotantoerien välistä yhdenmukaisuutta.
Jos aine on tarkoitettu terapeuttisiin sovelluksiin, puhtauden määrittäminen ( Purity Determination ) on entistäkin merkittävämpää. Lääkeaineiden puhtaus on ratkaisevan tärkeää niiden soveltuvuuden kannalta lääkekäyttöön. Epäpuhtaudet voivat aiheuttaa myrkyllisiä vaikutuksia tai heikentää lääkeaineen (API) stabiilisuutta ja biologista hyötyosuutta formulaation ja prosessoinnin aikana. Laadunvarmistuksen näkökulmasta tämä on erityisen merkittävää analyyttisten standardien osalta, joita käytetään vertailumateriaaleina menetelmien kehittämisessä, kalibroinnissa ja rutiinivalvonnassa.
Eutektiset epäpuhtaudet
Epäpuhtaus voi muodostaa eutektisen järjestelmän jonkin aineen kanssa, jos se liukenee nestemäiseen faasiin mutta ei liukene kiinteään faasiin. Differentiaalisessa skannauskalorimetriassa (DSC) tällaiset epäpuhtaudet voivat vaikuttaa materiaalin sulamiskäyttäytymiseen laskemalla havaittua sulamislämpötilaa ja laajentamalla sulamiskäyrän endotermistä osaa epäpuhtauspitoisuuden kasvaessa. Tämä sulamispisteen lasku on van’t Hoffin teorian [3] mukaisen sulamispisteen laskun ( Purity Determination ) perusta. Eutektiset epäpuhtaudet ovat siksi erityisen kriittisiä, sillä ne vaikuttavat sulamiskäyttäytymiseen ja haittaavat prosessoitavuutta. Siksi nopea lämpöpuhtausanalyysi on välttämätöntä laadunvalvonnan kannalta [4].
Analysoimalla sulamishuipun alkamista sulaneen osuuden funktiona aineen puhtaus voidaan arvioida van’t Hoffin yhtälön (yht. 1) avulla, kuten ASTM E928 -standardin menetelmässä A [5] kuvataan. Yhtälö yhdistää sulamispisteen laskun suuruuden eutektisten epäpuhtauksien pitoisuuteen.
Missä:
TS: näytteen lämpötila [K]
T0: puhtaan aineen Sulamislämpötilat ja lämpöarvotAineen fuusioentalpia, joka tunnetaan myös latenttina lämpönä, on mitta, jolla mitataan energiapanosta, yleensä lämpöä, joka tarvitaan aineen muuttamiseksi kiinteästä olomuodosta nestemäiseksi. Aineen sulamispiste on lämpötila, jossa aine vaihtaa olomuotoaan kiinteästä olomuodosta (kiteinen) nestemäiseksi olomuodoksi (isotrooppinen sula).sulamislämpötila [K]
R: kaasuvakio (= 8,314 J/mol-1·K-1)
x: epäpuhtauden mooliosuus
Hf: sulamislämpö [J·mol-1], laskettu piikin pinta-alasta
F: sulanut osuus
Näytteen epäpuhtauspitoisuuden määrittämiseksi on asetettava muutamia ehtoja:
- Aineen on oltava kiteinen. ∙ Aine ja epäpuhtaus eivät saa muodostaa kiinteitä liuoksia; toisin sanoen ne eivät sekoitu toisiinsa kiinteässä olomuodossa.
- Aine muodostaa epäpuhtauden kanssa eutektisen järjestelmän; tämä tarkoittaa, että aine ja epäpuhtaus muodostavat homogeenisen seoksen, joka sulaa ja jähmettyy kuten puhdas aine.
- Polymorfisia yhdisteitä on muutettava kokonaan yhdeksi polymorfiksi.
- Aine ei saa hajota sulamisen aikana.
Menettely puhtauden määrittämiseksi DSC:llä on kuvattu standardeissa USP <891>, Ph. Eur. 2.2.34 sekä useissa muissa standardeissa, kuten ASTM E928 ja DIN 51007 [3,6].
Erityisesti standardissa ASTM E928 [5] kuvataan ja standardoidaan DSC-menetelmälle ominaiset suorituskykykriteerit erittäin puhtaille aineille (pitoisuus >98,5 mol-%, c <20 %, poikkeama <0,5 mol-% vertailumenetelmiin nähden) sekä määritellään ne erityisedellytykset, joiden mukaisesti DSC-mittaukset on suoritettava.
Karbamatsepiini (CBZ) on synteettinen kouristuslääke, jonka Novartis-konserni löysi vuonna 1953 ja joka on ollut kaupallisesti saatavilla vuodesta 1962 lähtien (kuva 1). Puhdas aine on valkoista, kiteistä ja polymorfista jauhetta (muodot I–IV, dihydraatti), jonka Sulamislämpötilat ja lämpöarvotAineen fuusioentalpia, joka tunnetaan myös latenttina lämpönä, on mitta, jolla mitataan energiapanosta, yleensä lämpöä, joka tarvitaan aineen muuttamiseksi kiinteästä olomuodosta nestemäiseksi. Aineen sulamispiste on lämpötila, jossa aine vaihtaa olomuotoaan kiinteästä olomuodosta (kiteinen) nestemäiseksi olomuodoksi (isotrooppinen sula).sulamislämpötila-alue on 191–192 °C (muoto I) ja moolimassa 236,27 g/mol. CBZ:n vaikutusmekanismi perustuu jänniteohjatun Na+-kanavan estämiseen. Sen pääasiallinen lääketieteellinen käyttö on epilepsian, kolmoishermosärkyn ja kaksisuuntaisen mielialahäiriön hoidossa. CBZ:tä voidaan kuitenkin käyttää myös alkoholin vieroituksen aikana tai neuropaattisen kivun hoitoon [7,8].
Tässä tutkimuksessa sovelsimme van’t Hoffin kaaviota määrittääksemme epäpuhtauksien määrän kahdessa karbamatsepiinin analyysistandardissa, joiden puhtausasteet oli määritetty HPLC-menetelmällä. ASTM E928 -standardin mukaisesti arvioimme DSC-menetelmän soveltuvuutta ja luotettavuutt Identify small tällaisten vertailuaineiden puhtausasteiden eroissa.
Kokeellinen
DSC:n tuotteen ” Purity Determination ” osalta valittiin kaksi erilaista (sekundääristä) analyysistandardia, jotka sisälsivät samaa lääkeainetta, karbamatsepiinia (CBZ). Molemmat tuotteet olivat Sigma-Aldrichin (Merck KGaA) valmistamia ja täyttivät taulukossa 1 esitetyt valmistajan vaatimukset.
Taulukko 1: Kahden karbamatsepiinilaadun valmistajien teknisten tietojen vertailu [1,2]
| Parametri | Karbamatsepiini (CBZ-I) | Karbamatsepiini (CBZ-II) |
|---|---|---|
| Tuotenumero | 94496 | C4024 |
| Erä | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL-puhtaus | 99,9 % (määräys: ≥ 99,0 %) | 99 % (määräys: ≥ 98,0 %) |
| Ulkonäkö | Valkoinen jauhe | Valkoinen jauhe |
| Sulamispiste | 191–192 °C | 191–192 °C |
Valmistajan HPLC-analyysi paljasti 0,9 %:n eron puhtaudessa näiden kahden CBZ-näytteen välillä.
Tämä puhtausero voidaan validoida termisesti differentiaaliskannauskalorimetrian (DSC) mittauksilla (NETZSCH DSC 300 Caliris®Supreme ) sekä NETZSCH Proteus® 9 -ohjelmiston Purity Determination -toiminnolla.
NETZSCH in DSC 300 Caliris®Supreme ja Proteus® -ohjelmisto mahdollistavat ASTM-standardin mukaisen DSC-puhtausseulonnan pikatestinä, mikä on erityisen arvokasta laadunvalvonnan analyyttisten vertailustandardien seurannassa.
Mittausohjeet
Ennen analysointia NETZSCH DSC 300 -laitteella Caliris®Supreme alumiiniset Concavus® astiat puhdistettiin isopropanolilla ja lämpökäsiteltiin 425 °C:ssa yhden minuutin ajan. Näytteet (~1,5 mg) täytettiin tämän jälkeen puhdistettuihin upokaisiin ja suljettiin ilmatiiviisti.
Lämpötilaohjelma suunniteltiin alkamaan selvästi alle odotetun sulamisen alkamispisteen, jotta voitiin ottaa huomioon epäpuhtauksien aiheuttama sulamispisteen lasku. Menetelmässä käytettiin kaksivaiheista lämmitysprofiilia: aluksi nopea lämmitys 20 °C:sta 160 °C:seen nopeudella 20 K/min, jota seurasi hidas lämpötilan nousu nopeudella 0,7 K/min 160 °C:sta 200 °C:seen. Mittaus suoritettiin typpikaasussa 40 ml/min:n puhdistusvirtauksella, jotta kennossa säilyisi inertti ilmakehä koko kokeen ajan.
Mittaustulokset
Kuvassa 2 esitetään CBZ-l:n ja CBZ-ll:n ensimmäisen lämmityssyklin DSC-käyrät. CBZ-l:n ja CBZ-ll:n ekstrapoloidut lämpötilan nousun alkamislämpötilat 190 °C:ssa (CBZ-l: 190,2 °C / CBZ-ll: 190 °C) ovat yhdenmukaisia CBZ:n kirjallisuusarvojen kanssa (190,2 °C Liden mukaan, D.R:n [9] mukaan, mutta CBZ-l:n tapauksessa se on 0,2 °C korkeampi kuin CBZ-ll:n.
Kuten aiemmin todettiin, näytteen epäpuhtaudet laskevat sulamispistettä ja laajentavat DSC-käyrää. DSC-käyrän perusteella puhtausohjelmiston toiminto laskee van't Hoffin kaavion ja esittää DSC-puhtausanalyysin tiedot graafisesti; ks. kuva 3. Se piirtää sulamislämpötilan suhteessa sulaneen osuuden käänteislukuun (1/F), jossa F edustaa osuutta sulamishuipun kokonaispinta-alasta.
Käyrä ei yleensä ole lineaarinen, ja suurempi epälineaarisuus viittaa suurempaan epäpuhtausmäärään. Tämä poikkeama johtuu sulamisen esivaiheista, joita DSC-laite ei pysty havaitsemaan. Lisäksi mittausohjelma ja tietojen analysointi voivat myös vaikuttaa käyrän lineaarisuuteen. Esimerkiksi jos hitaan lämpötilan nousun vaihe aloitetaan liian lähellä sulamisen alkamista, tuloksena on virheellinen Sulamislämpötilat ja lämpöarvotAineen fuusioentalpia, joka tunnetaan myös latenttina lämpönä, on mitta, jolla mitataan energiapanosta, yleensä lämpöä, joka tarvitaan aineen muuttamiseksi kiinteästä olomuodosta nestemäiseksi. Aineen sulamispiste on lämpötila, jossa aine vaihtaa olomuotoaan kiinteästä olomuodosta (kiteinen) nestemäiseksi olomuodoksi (isotrooppinen sula).sulamislämpötilaTS. Jos lämpötila-alue on kuitenkin valittu oikein, piikin pinta-alan virheellinen asettaminen häiritsee piikin integrointirajoja, mikä vaikuttaa laskettuun sulamislämpöönHf. Molemmat tilanteet pahentavat käyrän epälineaarisuutta.
Lineaarisuuden saavuttamiseksi analyysiohjelmisto soveltaa korjauskerrointa c, joka lisätään suhteessa sekä piikin kokonaispinta-alaan että kuhunkin osapinta-alaan F. Tämä iteratiivinen säätö tuottaa korjatun F-arvon, joka muodostaa suoraviivaisen suhteen kaavassaTS = f(1/F)
Mitatun DSC-käyrän lisäksi ” Purity Determination ” -ohjelmistotoiminto vaatii puhtaan aineen molekyylipainon, jotta tulokset voidaan esittää mooliprosentteina. Lopullinen puhtausaste määritetään linearisoitujen tietojen kulmakertoimesta, kun taas ekstrapolaatio arvoon 1/F = 0 antaa 100-prosenttisen puhtaan aineen teoreettisen sulamislämpötilan. Tulokset ovat luotettavia vain, kun korjatut tiedot ovat lineaarisia, puhtausaste on yli 98,5 % ja korjauskerroin c on alle 20 % [4].
100-prosenttisen puhtaan CBZ:n teoreettinen Sulamislämpötilat ja lämpöarvotAineen fuusioentalpia, joka tunnetaan myös latenttina lämpönä, on mitta, jolla mitataan energiapanosta, yleensä lämpöä, joka tarvitaan aineen muuttamiseksi kiinteästä olomuodosta nestemäiseksi. Aineen sulamispiste on lämpötila, jossa aine vaihtaa olomuotoaan kiinteästä olomuodosta (kiteinen) nestemäiseksi olomuodoksi (isotrooppinen sula).sulamispiste on 190,425 °C CBZ-l:n osalta ja 190,411 °C CBZ-ll:n osalta, verrattuna sulamislämpötiloihin, jotka ovat vastaavasti 190,358 °C ja 190,320 °C. Mitatun CBZ-l-näytteen laskettu epäpuhtauspitoisuus oli 0,098 mooliprosenttia ja CBZ-ll:n 0,135 mooliprosenttia. Molempien näytteiden korjauskerroin on alle 10 %: CBZ-l:n osalta 4,633 % ja CBZ-ll:n osalta 6,978 %, mikä osoittaa tietojen korkean laadun ja ASTM-standardin mukaisuuden. Mittauksen jälkeen näyte punnittiin uudelleen, eikä massahäviötä havaittu. Tämä vahvistaa, ettei näytteen hajoamista tai haihtumista tapahtunut mittauksen aikana, mikä on myös ASTM-standardissa määritetyn 1 %:n suurimman sallitun massahäviön mukainen.
CBZ-l:n (99,9 % HPLC) puhtaus on 99,902 mol-%, kun taas CBZ-ll:n (99 % HPLC) puhtaus on 99,865 mol-%. Eroa 0,037 % pidetään marginaalisena, mutta se on tilastollisesti merkitsevä kaksisuuntaisen t-testin mukaan, vaikka toistojen rajallinen lukumäärä onkin otettava huomioon (kuva 4). CBZ-l:n alhaisempi c-arvo (4,8 % verrattuna 6,2 %:iin) viittaa vähäisempään esisulamiseen, mikä voi johtua korkeammasta puhtausasteesta [6].
Nämä tulokset vastaavat valmistajan antamia teknisiä tietoja ja vahvistavat siten tämän lämpöanalyyttisen menetelmän herkkyyden ja luotettavuuden. DSC-menetelmällä määritetyn puhtauden ero, 0,037 % (CBZ-l vs. CBZ-ll), johtuu yksinomaan eutektisista epäpuhtauksista, jotka ovat juuri niitä epäpuhtauksia, jotka DSC pystyy havaitsemaan. Havaittu epäpuhtaus on ASTM-menetelmän mittausalueella (< 1,5 mol-%) ja ylittää kvantitatiivisen havaitsemisrajan (0,001 mol-%).
Johtopäätös
Tämän tutkimuksen johtopäätöksenä on, että NETZSCH DSC 300 Caliris®Supreme yhdessä NETZSCH Proteus® -sivuston DSC-laitteille tarkoitetun Purity Determination -ohjelmistotoiminnon kanssa sopii erinomaisesti sulamisprosessiin vaikuttavien epäpuhtauksien seulontaan ja siten lukuisten lääkeaineiden puhtauden määrittämiseen, mukaan lukien eri analyyttisten standardien puhtausluokkien erottelu.
Kiitokset
Suuri kiitos Gabriele Kaiserille ja tohtori Stefan Schmölzerille heidän arvokkaasta panoksestaan tulosten teknisessä arvioinnissa ja tulkinnassa.