Indledning
Purity Determination er en central kvalitetskontrolforanstaltning, der skal sikre, at et stof er sikkert, pålideligt og egnet til den tilsigtede anvendelse. Den bekræfter identiteten og kvaliteten af den ønskede forbindelse efter isolering, syntese eller produktion og verificerer, at den er fri for væsentlige urenheder, såsom uomsatte udgangsmaterialer, biprodukter og forurenende stoffer. Denne analyse bidrager til at vurdere effektiviteten af en syntese- eller produktionsproces, angiver, om yderligere oprensning er påkrævet, og understøtter konsistensen mellem produktionspartier.
Hvis et stof er beregnet til terapeutiske anvendelser, bliver renhedsanalysen ( Purity Determination ) endnu mere relevant. Renheden af aktive farmaceutiske ingredienser er afgørende for deres egnethed til farmaceutisk brug. Urenheder kan forårsage toksiske virkninger eller kompromittere stabiliteten og biotilgængeligheden af den aktive farmaceutiske ingrediens (API) under formulering og forarbejdning. Set ud fra et kvalitetssikringsperspektiv er dette særligt relevant for analytiske standarder, som anvendes som referencematerialer til metodeudvikling, kalibrering og rutinemæssig kontrol.
Eutektiske urenheder
En urenhed kan danne et eutektisk system med et stof, hvis den er opløselig i den flydende fase, men uopløselig i den faste fase. Ved differentiel scanningskalorimetri (DSC) kan sådanne urenheder påvirke materialets smelteadfærd ved at sænke den observerede Smeltetemperaturer og entalpierEt stofs fusionsenthalpi, også kendt som latent varme, er et mål for den energitilførsel, typisk varme, der er nødvendig for at omdanne et stof fra fast til flydende tilstand. Et stofs smeltepunkt er den temperatur, hvor det skifter tilstand fra fast (krystallinsk) til flydende (isotropisk smelte).smeltetemperatur og udvide smelteendotermen, i takt med at indholdet af urenheder stiger. Dette smeltepunktsfald udgør grundlaget for den såkaldte » Purity Determination « i henhold til van’t Hoff-teorien [3]. Eutektiske urenheder er derfor særligt kritiske, da de påvirker smelteadfærden og forringer forarbejdeligheden. Derfor er hurtig termisk renhedsanalyse afgørende for kvalitetskontrol [4].
Ved at analysere begyndelsen af smeltetoppen som en funktion af den smeltede fraktion kan et stofs renhed estimeres ved hjælp af van’t Hoff-ligningen (ligning 1), som beskrevet i metode A i ASTM E928 [5]. Den knytter graden af smeltepunktssænkning til koncentrationen af eutektiske urenheder.
Hvor:
TS: prøvetemperatur [K]
T0: Smeltetemperaturer og entalpierEt stofs fusionsenthalpi, også kendt som latent varme, er et mål for den energitilførsel, typisk varme, der er nødvendig for at omdanne et stof fra fast til flydende tilstand. Et stofs smeltepunkt er den temperatur, hvor det skifter tilstand fra fast (krystallinsk) til flydende (isotropisk smelte).smeltetemperatur for det rene stof [K]
R: gaskonstant (= 8,314 J/mol-1·K-1)
x: molfraktion af urenhed
Hf: smeltevarme [J·mol-1], beregnet ud fra toparealet
F: smeltet fraktion
For at bestemme urenhedskoncentrationen i en prøve er det nødvendigt at fastlægge nogle betingelser:
- Stoffet skal være krystallinsk. ∙ Stoffet og urenheden må ikke danne faste opløsninger; det vil sige, at de ikke kan blandes i fast fase.
- Stoffet danner et eutektisk system med urenheden; det betyder, at stoffet og urenheden danner en homogen blanding, der smelter og størkner som et rent stof.
- Forbindelser, der udviser PolymorfismePolymorfisme er et fast materiales evne til at danne forskellige krystallinske strukturer (synonymer: former, modifikationer).polymorfisme, skal omdannes fuldstændigt til en enkelt polymorf form.
- Stoffet må ikke nedbrydes under smeltningen.
Fremgangsmåden til bestemmelse af renhed ved hjælp af DSC er beskrevet i USP <891>, Ph. Eur. 2.2.34 og i forskellige andre standarder, såsom ASTM E928 og DIN 51007 [3,6].
Specifikt beskriver og standardiserer ASTM E928 [5] de DSC-specifikke præstationskriterier for materialer med høj renhed (koncentration >98,5 mol-%, c <20%, afvigelse <0,5 mol-% i forhold til referencemetoder) og definerer de specifikke betingelser, under hvilke DSC-målingerne skal udføres.
Carbamazepin (CBZ) er et syntetisk antikonvulsivt middel, der blev opdaget i 1953 af Novartis-koncernen og har været kommercielt tilgængeligt siden 1962 (figur 1). Det rene stof er et hvidt, krystallinsk og polymorf pulver (form I–IV, dihydrat) med et smelteinterval på 191–192 °C (form I) og en molmasse på 236,27 g/mol. Virkningsmekanismen for CBZ er baseret på hæmning af spændingsafhængige Na+-kanaler. Det anvendes primært inden for lægemiddelområdet til behandling af epilepsi, trigeminusneuralgi og bipolare lidelser. CBZ kan dog også anvendes under alkoholafvænning eller til behandling af neuropatisk smerte [7,8].
I denne undersøgelse anvendte vi van’t Hoff-plottet til at bestemme mængden af urenheder i to analytiske standarder af carbamazepin med forskellige HPLC-bestemte renhedsgrader. I overensstemmelse med ASTM E928-standarden vurderede vi DSC-metodens anvendelighed og pålidelighed til Identify small at påvise forskelle i renheden af sådanne referencematerialer.
Eksperimentel
Til » Purity Determination « fra DSC blev der udvalgt to forskellige (sekundære) analysestandarder af det samme aktive lægemiddelstof, carbamazepin (CBZ). Begge produkter var fremstillet af Sigma-Aldrich (Merck KGaA) og opfyldte producentens specifikationer, som fremgår af tabel 1.
Tabel 1: Sammenligning af producenternes specifikationer for de to kvaliteter af carbamazepin [1,2]
| Parameter | Carbamazepin (CBZ-I) | Carbamazepin (CBZ-II) |
|---|---|---|
| Produktnummer | 94496 | C4024 |
| Batch | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL-renhed | 99,9 % (specifikation: ≥ 99,0 %) | 99 % (specifikation: ≥ 98,0 %) |
| Udseende | Hvidt pulver | Hvidt pulver |
| Smeltepunkt | 191 til 192 °C | 191 til 192 °C |
Producentens HPLC-analyse viste en forskel på 0,9 % i renhed mellem de to CBZ-prøver.
Denne forskel i renhed kan valideres termisk ved hjælp af DSC-målinger (Differential Scanning Calorimetry) (NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme ) og funktionen » Purity Determination « i softwaren NETZSCH Proteus® 9.
NETZSCH -softwaren DSC 300 Caliris® Supreme og Proteus® muliggør ASTM-konform DSC-renhedsscreening som en hurtig test, hvilket er særligt værdifuldt til overvågning af analytiske referencestandarder til kvalitetskontrol.
Måleprotokol
Forud for analysen med NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme blev aluminiums Concavus® -beholdere renset i isopropanol og termisk konditioneret ved 425 °C i et minut. Prøverne (~1,5 mg) blev derefter hældt i de rensede digler og hermetisk forseglet.
Temperaturprogrammet blev udformet således, at opvarmningen påbegyndtes et godt stykke under den forventede smeltepunktstart for at tage højde for smeltepunktsforringelse forårsaget af urenheder. Protokollen anvendte en to-trins opvarmningsprofil: indledende hurtig opvarmning fra 20 °C til 160 °C med 20 K/min, efterfulgt af en langsom temperaturstigning på 0,7 K/min fra 160 °C til 200 °C. Målingen blev udført under nitrogen med en rensestrøm på 40 ml/min for at opretholde en inert atmosfære i cellen under hele eksperimentet.
Måleresultater
Figur 2 viser DSC-kurverne for den første opvarmningscyklus for CBZ-l og CBZ-ll. De ekstrapolerede starttemperaturer ved 190 °C for CBZ-l: 190,2 °C / CBZ-ll: 190 °C stemmer overens med litteraturværdierne for CBZ, 190,2 °C ifølge Lide, D.R [9], men i tilfældet med CBZ-l er den 0,2 °C højere end for CBZ-ll.
Som tidligere nævnt vil urenheder i prøven sænke smeltepunktet og dermed udvide DSC-kurven. Ud fra DSC-kurven beregner renhedssoftwarefunktionen van't Hoff-plottet og giver en grafisk fremstilling af dataene fra DSC-renhedsanalysen; se figur 3. Den plotter smeltetemperaturen mod det reciprokke af den smeltede fraktion (1/F), hvor F repræsenterer andelen af det samlede smeltepeakareal.
Kurven er typisk ikke lineær, og en større ikke-linearitet indikerer en højere mængde urenheder. Denne afvigelse skyldes effekter, der opstår før smeltningen, og som ikke kan påvises ved hjælp af DSC. Desuden kan måleprogrammet og dataanalysen også påvirke kurvens linearitet. Hvis man f.eks. starter det segment, hvor temperaturen stiger langsomt, for tæt på smeltestartpunktet, vil det give en forkert Smeltetemperaturer og entalpierEt stofs fusionsenthalpi, også kendt som latent varme, er et mål for den energitilførsel, typisk varme, der er nødvendig for at omdanne et stof fra fast til flydende tilstand. Et stofs smeltepunkt er den temperatur, hvor det skifter tilstand fra fast (krystallinsk) til flydende (isotropisk smelte).smeltetemperatur,TS. Men hvis man har valgt temperaturområdet korrekt, vil en forkert indstilling af toparealet forstyrre grænserne for topintegrationen og dermed påvirke den beregnede smeltevarme,Hf. Begge situationer vil forværre kurvens ikke-linearitet.
For at opnå linearitet anvender analysesoftwaren en korrektionsfaktor, c, som lægges proportionalt til både det samlede topareal og hvert delareal, F. Denne iterative justering giver en korrigeret F-værdi, der skaber et lineært forhold iTS = f(1/F)
Ud over den opnåede DSC-kurve kræver funktionen » Purity Determination « i softwaren, at molekylvægten af det rene stof angives for at kunne levere resultater i mol-%. Den endelige renhed bestemmes ud fra hældningen af de lineariserede data, mens ekstrapolering til 1/F = 0 giver den teoretiske Smeltetemperaturer og entalpierEt stofs fusionsenthalpi, også kendt som latent varme, er et mål for den energitilførsel, typisk varme, der er nødvendig for at omdanne et stof fra fast til flydende tilstand. Et stofs smeltepunkt er den temperatur, hvor det skifter tilstand fra fast (krystallinsk) til flydende (isotropisk smelte).smeltetemperatur for det 100 % rene materiale. Resultaterne er kun pålidelige, når de justerede data viser linearitet, renhedsgraden er højere end 98,5 %, og korrektionsfaktoren, c, er lavere end 20 % [4].
Det teoretiske Smeltetemperaturer og entalpierEt stofs fusionsenthalpi, også kendt som latent varme, er et mål for den energitilførsel, typisk varme, der er nødvendig for at omdanne et stof fra fast til flydende tilstand. Et stofs smeltepunkt er den temperatur, hvor det skifter tilstand fra fast (krystallinsk) til flydende (isotropisk smelte).smeltepunkt for 100 % rent CBZ udgør 190,425 °C for CBZ-l og 190,411 °C for CBZ-ll, sammenlignet med smeltetemperaturen på henholdsvis 190,358 °C og 190,320 °C. Det beregnede urenhedsindhold i den målte CBZ-l-prøve var 0,098 mol-%, og for CBZ-ll 0,135 mol-%. Korrektionsfaktoren for begge prøver er under 10 %, nemlig 4,633 % for CBZ-l og 6,978 % for CBZ-ll, hvilket vidner om dataenes høje kvalitet og overensstemmelse med ASTM-standarden. Efter målingen blev prøven vejet igen, og der blev ikke påvist noget massetab. Dette bekræfter, at der hverken fandt NedbrydningsreaktionEn nedbrydningsreaktion er en termisk induceret reaktion af en kemisk forbindelse, der danner faste og/eller gasformige produkter. nedbrydning af prøven eller FordampningFordampning af et grundstof eller en forbindelse er en faseovergang fra væskefase til damp. Der findes to typer fordampning: fordampning og kogning.fordampning sted under målingen, hvilket også er i overensstemmelse med det maksimale massetab på 1 %, der er specificeret i ASTM-standarden.
Renheden af CBZ-l (99,9 % HPLC) er 99,902 mol-%, mens renheden af CBZ-ll (99 % HPLC) er 99,865 mol-%. Forskellen på 0,037 % anses for at være marginal, men statistisk signifikant ifølge en tosidet t-test, selvom det begrænsede antal gentagelser bør tages i betragtning (figur 4). Den lavere c-værdi for CBZ-l (4,8 % mod 6,2 %) tyder på mindre forsmeltning, hvilket kan skyldes en højere renhedsgrad [6].
De foreliggende resultater afspejler producentens specifikationer og underbygger dermed følsomheden og pålideligheden af denne termoanalytiske metode. Forskellen i den DSC-bestemte renhed på 0,037 % (CBZ-l vs. CBZ-ll) afspejler udelukkende eutektiske urenheder, hvilket er den type urenhed, som DSC kan påvise. Den påviste urenhed ligger inden for ASTM-metodens måleområde, < 1,5 mol%, og overstiger den kvantitative detektionsgrænse på 0,001 mol%.
Konklusion
Denne undersøgelse konkluderer, at NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme , i kombination med softwarefunktionen Purity Determination fra NETZSCH Proteus® til DSC, er særdeles velegnet til screening af urenheder, der påvirker smelteprocessen, og dermed til bestemmelse af renheden af en lang række lægemidler, herunder differentiering mellem renhedsklasser for forskellige analytiske standarder.
Tak
En stor tak til Gabriele Kaiser og dr. Stefan Schmölzer for deres værdifulde bidrag til den tekniske evaluering og fortolkningen af resultaterne.