서론
Purity Determination 이는 물질이 안전하고 신뢰할 수 있으며 의도된 용도에 적합한지 확인하기 위한 핵심 품질 관리 조치입니다. 이 과정은 분리, 합성 또는 생산 후 목표 화합물의 정체와 품질을 확인하고, 미반응 원료, 부산물, 오염 물질과 같은 주요 불순물이 포함되어 있지 않은지 검증합니다. 이 분석은 합성 또는 생산 공정의 효율성을 평가하고, 추가 정제가 필요한지 여부를 판단하며, 생산 배치 간의 일관성을 유지하는 데 기여합니다.
해당 물질이 치료 용도로 사용될 경우, 정제 분석( Purity Determination )의 중요성은 더욱 커집니다. 의약 활성 성분의 순도는 의약품 용도로의 적합성을 결정하는 데 매우 중요합니다. 불순물은 독성 효과를 유발하거나 제형화 및 가공 과정에서 의약 활성 성분(API)의 안정성과 생체 이용률을 저해할 수 있습니다. 품질 보증 관점에서 볼 때, 이는 분석법 개발, 교정 및 일상적인 관리에 기준 물질로 사용되는 분석 표준 물질에 특히 중요합니다.
공융 불순물
불순물은 액상에서는 용해되지만 고상에서는 용해되지 않는 경우, 해당 물질과 공융계를 형성할 수 있다. 차동 주사 열량 분석법(DSC)에서 이러한 불순물은 불순물 함량이 증가함에 따라 관측되는 용융 온도를 낮추고 용융 흡열 곡선을 넓힘으로써 물질의 용융 거동에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 융점 강하 현상은 반트 호프(van’t Hoff) 이론[3]에 따른 용융점 강하법( Purity Determination )의 기초가 됩니다. 따라서 공융 불순물은 용융 거동에 영향을 미치고 가공성을 저해하므로 특히 문제가 됩니다. 따라서 품질 관리를 위해서는 신속한 열적 순도 분석이 필수적입니다[4].
ASTM E928 [5]의 방법 A에 설명된 바와 같이, 용융 피크의 시작점을 용융 분율의 함수로 분석함으로써 반트 호프 방정식(식 1)을 사용하여 물질의 순도를 추정할 수 있습니다. 이 방정식은 융점 강하도를 공융 불순물의 농도와 연관 짓습니다.
다음에서:
TS: 시료 온도 [K]
T0: 순수 물질의 녹는점 [K]
R: 기체 상수 (= 8.314 J/mol⁻¹·K⁻¹)
x: 불순물의 몰 분율
Hf: 융해열 [J·mol⁻¹], 피크 면적으로부터 계산됨
F: 용융 분율
시료 내 불순물 농도를 측정하기 위해서는 몇 가지 조건을 설정해야 합니다.
- 해당 물질은 결정질이어야 한다. ∙ 해당 물질과 불순물은 공용체를 형성해서는 안 되며, 즉 고체 상에서 서로 혼합되지 않아야 한다.
- 해당 물질은 불순물과 공융계를 형성해야 한다. 즉, 해당 물질과 불순물은 순수 물질처럼 녹고 굳는 균질한 혼합물을 형성해야 한다.
- 다형성을 나타내는 화합물은 반드시 단일 다형체로 완전히 전환되어야 한다.
- 물질은 용융 과정에서 분해되어서는 안 됩니다.
DSC를 이용한 순도 측정 절차는 USP <891>, Ph. Eur. 2.2.34 및 ASTM E928, DIN 51007 [3,6]과 같은 다양한 다른 표준에 기술되어 있습니다.
특히 ASTM E928 [5]은 고순도 물질(농도 >98.5 mol-%, c <20%, 기준 방법에 비해 편차 <0.5 mol-%)에 대한 DSC 관련 성능 기준을 설명하고 표준화하며, DSC 측정을 수행해야 하는 구체적인 조건을 정의하고 있습니다.
카르바마제핀(CBZ)은 1953년 노바티스 그룹에 의해 발견된 합성 항경련제로, 1962년부터 시판되고 있다(그림 1). 순수 물질은 백색의 결정질 다형성 분말(I~IV형, 이수화물)로, 융점 범위는 191~192°C(I형)이며, 몰 질량은 236.27 g/mol입니다. CBZ의 작용 기전은 전압 의존성 Na+ 채널의 억제에 기반한다. 이 약물의 주요 의학적 용도는 간질, 삼차신경통 및 양극성 장애의 치료이다. 그러나 CBZ는 알코올 금단 증상 완화나 신경병성 통증 치료에도 사용될 수 있다 [7,8].
본 연구에서는 반트 호프(van’t Hoff) 플롯을 적용하여, HPLC로 측정된 순도가 서로 다른 두 가지 카르바마제핀 분석 표준물의 불순물 함량을 측정하였다. ASTM E928 표준에 따라, 이러한 기준 물질의 순도 차이( Identify small )에 대한 DSC법의 적용 가능성과 신뢰성을 평가하였다.
실험적
DSC의 ‘ Purity Determination ’을 위해, 동일한 원료의약품인 카르바마제핀(CBZ)의 서로 다른 두 가지 (2차) 분석 표준물을 선정하였다. 두 제품 모두 시그마-알드리치(Merck KGaA)에서 제조되었으며, 표 1에 제시된 제조사의 규격을 충족하였다.
표 1: 두 가지 등급의 카르바마제핀에 대한 제조사 사양 비교 [1,2]
| 항목 | 카르바마제핀 (CBZ-I) | 카르바마제핀 (CBZ-II) |
|---|---|---|
| 제품 번호 | 94496 | C4024 |
| 배치 | BCCM1539 | MKCT3831 |
| HPCL 순도 | 99.9% (규격: ≥ 99.0%) | 99% (규격: ≥ 98.0%) |
| 외관 | 백색 분말 | 백색 분말 |
| 융점 | 191~192°C | 191~192°C |
제조사의 HPLC 분석 결과, 두 CBZ 시료 간의 순도 차이가 0.9%인 것으로 나타났습니다.
이러한 순도 차이는 차동 주사 열량계(DSC) 측정(NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme )과 NETZSCH Proteus® 9 소프트웨어의 ‘ Purity Determination ’ 기능을 사용하여 열적으로 검증할 수 있습니다.
NETZSCH 의 DSC 300 Caliris® Supreme 및 Proteus® 소프트웨어는 ASTM 표준을 준수하는 DSC 순도 선별을 신속한 테스트로 수행할 수 있게 해주며, 특히 품질 관리를 위한 분석 기준 표준 물질의 모니터링에 매우 유용합니다.
측정 프로토콜
NETZSCH DSC 300 Caliris® Supreme 를 이용한 분석에 앞서, 알루미늄 Concavus® 팬을 이소프로판올로 세척하고 425°C에서 1분간 열적 조건을 조절하였다. 그 후, 세척된 도가니에 시료(약 1.5 mg)를 채우고 밀폐하였다.
온도 프로그램은 불순물에 의한 융점 저하를 고려하여, 예상되는 융해 시작 온도보다 훨씬 낮은 온도에서 시작되도록 설계되었다. 이 프로토콜은 2단계 가열 프로파일을 채택했습니다. 첫 번째 단계는 20 K/min의 속도로 20°C에서 160°C까지 급속 가열하고, 두 번째 단계는 0.7 K/min의 속도로 160°C에서 200°C까지 서서히 온도를 상승시키는 것이었습니다. 측정은 실험 전반에 걸쳐 셀 내의 불활성 분위기를 유지하기 위해 40 ml/min의 퍼징 유량으로 질소 가스 하에서 수행되었습니다.
측정 결과
그림 2는 CBZ-l 및 CBZ-ll의 첫 번째 가열 주기에 대한 DSC 곡선을 보여준다. CBZ-l: 190.2°C / CBZ-ll: 190°C로 외삽된 발열 시작 온도는 문헌에 보고된 CBZ의 값(Lide에 따르면 190.2°C, D.R [9]에 따르면 CBZ의 문헌값인 190.2°C와 일치하지만, CBZ-l의 경우 CBZ-ll보다 0.2°C 더 높다.
앞서 언급한 바와 같이, 시료에 불순물이 포함되면 용융점이 낮아지고 DSC 곡선이 넓어집니다. DSC 곡선을 바탕으로, 순도 분석 소프트웨어 기능은 반트 호프(van't Hoff) 플롯을 계산하고 DSC 순도 분석 데이터를 그래픽으로 표시합니다(그림 3 참조). 이 플롯은 용융 온도를 용융 분율(F)의 역수(1/F)에 대해 그래프로 나타내며, 여기서 F는 전체 용융 피크 면적에서 차지하는 비율을 나타냅니다.
일반적으로 그래프는 선형적이지 않으며, 비선형성이 클수록 불순물의 양이 많음을 나타냅니다. 이러한 편차는 DSC로는 감지할 수 없는 용융 전 효과에서 기인합니다. 또한, 측정 프로그램과 데이터 분석 역시 그래프의 선형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 저속 온도 상승 구간을 용융 개시점과 너무 가까운 지점에서 시작하면 잘못된 용융 온도(TS)가 산출됩니다. 반면, 온도 범위를 적절히 선정했더라도 피크 면적을 잘못 설정하면 피크 적분 경계에 오류가 발생하여 계산된 융해열(Hf)에 영향을 미칩니다. 두 경우 모두 그래프의 비선형성을 악화시킵니다.
선형성을 확보하기 위해 분석 소프트웨어는 보정 계수 c를 적용하며, 이는 총 피크 면적과 각 분수 면적 F에 비례하여 더해진 값입니다. 이러한 반복적인 조정을 통해 보정된 F 값이 도출되며, 이를 통해TS = f(1/F)에서 직선 관계를 얻을 수 있습니다.
획득된 DSC 곡선 외에도, ‘ Purity Determination ’ 소프트웨어 기능을 사용하려면 몰(%) 단위의 결과를 산출하기 위해 순수 물질의 분자량이 필요합니다. 최종 순도는 선형화된 데이터의 기울기를 통해 결정되며, 1/F = 0까지 외삽하면 100% 순수 물질의 이론적 용융 온도를 구할 수 있습니다. 이 결과는 보정된 데이터가 선형성을 보이고, 순도가 98.5% 이상이며, 보정 계수 c가 20% 미만일 때만 신뢰할 수 있습니다 [4].
100% 순수 CBZ의 이론적 녹는점은 CBZ-l의 경우 190.425°C, CBZ-ll의 경우 190.411°C이며, 반면 실제 측정된 용융 온도는 각각 190.358°C와 190.320°C였다. 측정된 CBZ-l 시료의 계산된 불순물 함량은 0.098 몰%였으며, CBZ-ll의 경우 0.135 몰%였다. 두 시료의 보정 계수는 모두 10% 미만이며, CBZ-l은 4.633%, CBZ-ll은 6.978%로, 이는 데이터의 높은 품질과 ASTM 표준 준수를 입증한다. 측정 후 시료를 다시 계량한 결과, 질량 손실은 검출되지 않았습니다. 이는 측정 중 시료의 분해나 휘발이 발생하지 않았음을 확인시켜 주며, 이는 ASTM 표준에 명시된 최대 질량 손실률 1%를 준수한 것임을 의미합니다.
CBZ-l(99.9% HPLC)의 순도는 99.902 mol%이고, CBZ-ll(99% HPLC)의 순도는 99.865 mol%이다. 0.037%의 차이는 미미한 것으로 간주되지만, 양측 t-검정에 따르면 통계적으로 유의미한 것으로 나타났으며, 다만 제한된 반복 횟수를 고려해야 합니다(그림 4). CBZ-l의 c-값이 더 낮음(4.8% 대 6.2%)은 사전 용융이 적음을 시사하며, 이는 더 높은 순도 때문일 수 있다 [6].
이번 결과는 제조사의 사양을 반영하고 있으므로, 이 열분석법의 민감도와 신뢰성을 뒷받침합니다. DSC로 측정된 순도 차이 0.037%(CBZ-l 대 CBZ-ll)는 DSC가 검출할 수 있는 불순물인 공융 불순물만을 반영합니다. 검출된 불순물은 ASTM 방법의 범위인 1.5 몰% 미만이며, 0.001 몰%의 정량 검출 한계를 초과합니다.
결론
본 연구는 NETZSCH 의 DSC 300 Caliris® Supreme 이 NETZSCH Proteus® 의 DSC용 Purity Determination 소프트웨어 기능과 결합될 경우, 용융 과정에 영향을 미치는 불순물을 선별하는 데 이상적이며, 결과적으로 다양한 의약품의 순도를 측정하고 서로 다른 분석 표준물의 순도 등급을 구분하는 데에도 적합하다는 결론을 내렸다.
감사의 말
기술적 평가와 결과 해석에 귀중한 기여를 해 주신 가브리엘레 카이저(Gabriele Kaiser) 씨와 슈테판 슈뫼르처(Stefan Schmölzer) 박사님께 깊은 감사를 드립니다.