Úvod
Lyofilizace je technika široce používaná ve farmaceutických technologiích k přeměně termolabilních látek, jako jsou proteiny nebo lipozomy, bez tepelné úpravy do použitelné a skladovatelné formy. Cílem lyofilizace je šetrné odstranění vody z roztoků a získání stabilního prášku s definovanou zbytkovou vlhkostí a pórovitostí.
Složení výrobku má rozhodující vliv na parametry procesu, a tím také na typ, kvalitu a stabilitu výsledného lyofilizátu. Dynamická skenovací kalorimetrie (DSC) poskytuje důležité informace pro výběr vhodných podmínek.
Roztoky určené k lyofilizaci jsou obvykle složité vícesložkové systémy sestávající z účinných látek, přídatných látek a vody. Pomocné látky zahrnují tonizační soli (pro úpravu izotonicity), pufrovací látky, kryoprotektory (pro ochranu před poškozením během zmrazování) a stavební látky, které dodávají lyofilizátu strukturu. Jako velmi účinné se při stabilizaci proteinů ukázaly cukry, jako je sacharóza nebo trehalóza [5]. Následující úvahy vycházejí ze sacharózy jako modelové látky. Uvedené roztoky byly vyrobeny z komerčně dostupné sacharózy farmaceutické kvality (Caesar & Loretz, Hilden) a dvakrát destilované vody.
Proces lyofilizace lze obecně rozdělit do 3 po sobě jdoucích kroků:
Hluboké zmrazení
Cukerné roztoky mají tendenci se přesycovat. Po ochlazení se tvoří led a stále viskóznější roztok sacharózy. Zvyšující se viskozita komplikuje difuzní procesy, které by byly nezbytné pro krystalizaci. V důsledku toho systém nekrystalizuje, ale tuhne jako podchlazená kapalina bez úplného oddělení fází (sklo). Teplota skelného přechodu maximálně koncentrovaného roztoku se označuje Tg' a je specifická pro danou látku [3].
Během ochlazování lze často pozorovat přechlazování. Extrémní případ představují farmaceutické roztoky pro parenterální aplikaci (podání vyhýbající se gastrointestinálnímu traktu), které musí být bez částic. Nemají prakticky žádné heterogenní nečistoty, které by mohly působit jako krystalizační jádra. Proto je krystalová nukleace v těchto roztocích často pravděpodobná až při teplotě blížící se -40 °C.
Chování 10% roztoku sacharózy při mrznutí je znázorněno na obrázku 2. Vzorek byl chlazen pomocí přístroje NETZSCH DSC 204 F1 (viz obr. 1) v uzavřeném hliníkovém kelímku při řízené rychlosti chlazení 5 K/min. Přechlazený roztok tuhne extrémně rychle při -20 °C (extrapolovaná teplota nástupu).
Drsné skvrny na vnitřní straně kelímku nebo stopy znečištění způsobené přípravou mohou sloužit jako krystaly. Z tohoto důvodu nelze takto stanovené teploty tuhnutí obecně korelovat s koncentrací použitých cukerných roztoků.
Během přechodu z vody na led dochází ke změně měrného tepla ze 4,18 J/g-K (voda) na 2,1 J/g-K (led, těsně pod bodem mrazu), což je primárně zodpovědné za zřetelný posun základní linie před a za vrcholem tuhnutí/tání (obr. 2: přechod z vody na led - a obr. 3: přechod z ledu na vodu).
Při následném zahřívání rychlostí 5 K/min (obr. 3) se skelný přechod maximálně koncentrovaného roztoku objeví při -32 °C (střední bod). Tato hodnota je v dobré shodě s literárními údaji předpokládajícími -32 °C a -33 °C [2], [4].
Po skelném přechodu následuje při zahřívání endotermický pík (vložka na obr. 3), jehož extrapolovaná teplota nástupu, Tm´, popisuje počátek tání ledu. Podle Roose [1] lze maximální "koncentraci mrazu" pozorovat pouze při teplotách tuhnutí mezi Tg´a Tm´.
Oblast pod vrcholem tání odpovídá podílu volné vody. Referenčním bodem je zde teplo tání ledu 333,7 J/g.
U roztoků s nízkou koncentrací lze podíl sacharózy určit z výšky příslušného skelného přechodu. Na obrázku 4 jsou výšky kroku (hodnoty ΔMěrná tepelná kapacita (cp)Tepelná kapacita je fyzikální veličina specifická pro daný materiál, která se určuje jako podíl množství tepla dodaného vzorku a výsledného zvýšení teploty. Měrná tepelná kapacita se vztahuje k jednotkové hmotnosti vzorku.cp) pro roztoky o koncentraci 5 %, 10 % a 20 % - s výsledky 0,127 J/g-K, 0,258 J/g-K a 0,516 J/g-K - ve velmi dobré shodě se škálováním koncentrace koeficientem 2, přičemž teploty skelného přechodu zůstávají do značné míry konstantní. Mezi výškou kroku a koncentrací existuje lineární závislost (obr. 5).
Kromě toho se s rostoucí koncentrací roztoků sacharózy posunuje počátek tání ledu (extrapolovaná teplota nástupu) k nižším hodnotám na obrázku 6. Při vyšších koncentracích to vede ke zkrácení intervalu mezi skelným přechodem maximálně koncentrovaného roztoku a počátkem tání volné vody.
Některé amorfní látky při zahřátí nad teplotu skla opět krystalizují. Tento efekt, nazývaný devitrifikace nebo studená KrystalizaceKrystalizace je fyzikální proces tuhnutí při vzniku a růstu krystalů. Při tomto procesu se uvolňuje krystalizační teplo.krystalizace, lze využít ke změně pórovitosti a zbytkové vlhkosti lyofilizátu [2] temperováním materiálu nad teplotu rekrystalizace (extrapolovaný počátek). V důsledku rekrystalizace dochází k oddělení fází a uvolněná "nezmrzlá" voda se mění na led. Jak však ukazuje obrázek 3, v případě sacharózy k postkrystalizaci nedochází.
Primární sušení
V tomto kroku se zmrzlý led odstraňuje ve vakuu sublimací (přechod z pevného do plynného skupenství).
Během tohoto procesu - při němž je teplo dodáváno zvenčí - by teplota ve výrobku neměla stoupnout nad teplotu skelného přechodu, protože to vede k měknutí rámcové struktury a kolapsu systému [5]. Destrukce rámcové struktury během fáze sušení se nazývá kolaps.
Ačkoli se uvádějí teploty kolapsu, které jsou v průměru o 1 až 5 K vyšší než odpovídající teploty skelného přechodu [6], dobrým referenčním bodem pro jejich polohu jsou skelné přechody maximálně koncentrovaných roztoků, Tg´, které lze stanovit pomocí DSC.
Sekundární sušení
V tomto kroku se výrobek vysuší na požadovanou konečnou úroveň vlhkosti desorpcí vody obsažené v matrici pomalým zvyšováním teploty.
V amorfních lyofilizátech musí voda difundovat ze sklovité fáze na povrch. Tento poměrně pomalý proces je důvodem, proč je krok po sušení často tím, který určuje rychlost lyofilizace amorfních lyofilizátů [2].
V důsledku změkčujícího účinku vody je teplota skelného přechodu amorfní fáze přímo závislá na obsahu zachycené vody. S postupujícím odvodňováním se Tg (skelný přechod sacharosy jako pevné látky) zvyšuje; jeho polohu lze také rychle a přesně určit pomocí DSC.
Závěr
Základními charakteristikami pro návrh procesu primárního sušení jsou teplota skelného přechodu maximálně koncentrovaného roztoku (Tg´) a teplota kolapsu, při které materiál změkne natolik, že již není schopen udržet svou vlastní strukturu a začne téct. Pomocí DSC (někdy jako TM-DSC*) lze snadno určit Tg´.
Teplota kolapsu je o něco vyšší než Tg´; přesný interval mezi Tg´a teplotou kolapsu závisí na složení.