Introduktion
Frysetørring (lyofilisering) er en teknik, der i vid udstrækning anvendes i farmaceutiske teknologier til at omdanne termolabile stoffer som proteiner eller liposomer - uden termisk behandling - til anvendelige og lagringsdygtige former. Formålet med frysetørring er skånsomt at fjerne vand fra opløsninger for at opnå et stabilt pulver med defineret restfugtighed og porøsitet.
Et produkts sammensætning har afgørende indflydelse på procesparametrene og dermed også på typen, kvaliteten og stabiliteten af det resulterende lyofilisat. Dynamisk scanningskalorimetri (DSC) giver vigtige oplysninger til valg af passende betingelser.
De opløsninger, der skal frysetørres, er normalt komplekse flerkomponentsystemer, der består af aktive ingredienser, tilsætningsstoffer og vand. Hjælpestofferne omfatter toningssalte (til justering af isotonicitet), bufferstoffer, kryoprotektorer (til beskyttelse mod skader under frysning) og byggesten, der giver struktur til det frysetørrede produkt. Sukkerarter som saccharose eller trehalose har vist sig at være meget effektive til at stabilisere proteiner [5]. De følgende overvejelser er baseret på saccharose som modelstof. De nævnte opløsninger blev fremstillet af kommercielt tilgængelig saccharose af farmaceutisk kvalitet (Caesar & Loretz, Hilden) og dobbeltdestilleret vand.
Frysetørringsprocessen kan generelt opdeles i 3 på hinanden følgende trin:
Dybfrysning
Sukkeropløsninger har en tendens til at blive overmættede. Ved afkøling dannes der is og en mere og mere tyktflydende saccharoseopløsning. Den stigende viskositet komplicerer diffusionsprocesser, som ville være nødvendige for KrystalliseringKrystallisering er den fysiske hærdningsproces under dannelse og vækst af krystaller. Under denne proces frigives krystallisationsvarme.krystallisering. Resultatet er, at systemet ikke krystalliserer, men størkner som en underafkølet væske uden fuldstændig faseseparation (glas). Glasovergangstemperaturen for den maksimalt koncentrerede opløsning betegnes Tg' og er stofspecifik [3].
Under afkøling kan der ofte observeres underafkøling. Farmaceutiske opløsninger til parenteral anvendelse (administration uden om mave-tarmkanalen), som skal være partikelfri, repræsenterer et ekstremt tilfælde. De har stort set ingen heterogene urenheder, der kan fungere som krystalliseringskerner. Derfor er det ofte kun sandsynligt, at der dannes krystalkerner i sådanne opløsninger, når temperaturen nærmer sig -40 °C.
Fryseadfærden for en 10 % saccharoseopløsning er vist i figur 2. Prøven blev afkølet med NETZSCH DSC 204 F1 (se figur 1) i en lukket aluminiumdigel med en kontrolleret afkølingshastighed på 5 K/min. Den underafkølede opløsning størkner ekstremt hurtigt ved -20 °C (ekstrapoleret begyndelsestemperatur).
Ujævne pletter på indersiden af diglen eller spor af forurening forårsaget af tilberedning kan fungere som frøkrystaller. Derfor kan størkningstemperaturer bestemt på denne måde generelt ikke korreleres med koncentrationen af de anvendte sukkeropløsninger.
Under overgangen fra vand til is sker der en ændring i den specifikke varme fra 4,18 J/g-K (vand) til 2,1 J/g-K (is, lige under frysepunktet), som primært er ansvarlig for den tydelige forskydning af basislinjen før og efter størknings-/smeltetoppen (fig. 2: overgang fra vand til is - og fig. 3: overgang fra is til vand).
Ved den efterfølgende opvarmning med en opvarmningshastighed på 5 K/min (figur 3) vises glasovergangen for den maksimalt koncentrerede opløsning ved -32 °C (midtpunkt). Denne værdi er i god overensstemmelse med litteraturdata, der antager -32 °C og -33 °C [2], [4].
Glasovergangen efterfølges af en endotermisk top under opvarmning (indsat i figur 3), hvis ekstrapolerede begyndelsestemperatur, Tm´, beskriver starten på smeltningen af isen. Ifølge Roos [1] kan den maksimale "frysekoncentration" kun observeres ved frysetemperaturer mellem Tg´og Tm´.
Området under smeltetoppen svarer til den frie vandandel. Referencepunktet her er isens smeltevarme på 333,7 J/g.
I opløsninger med lav koncentration kan saccharoseandelen bestemmes ud fra højden af den respektive glasovergang. I figur 4 er trinhøjderne (ΔSpecifik varmekapacitet (cp)Varmekapacitet er en materialespecifik fysisk størrelse, der bestemmes af den mængde varme, der tilføres prøven, divideret med den resulterende temperaturstigning. Den specifikke varmekapacitet er relateret til en masseenhed af prøven.cp-værdier) for opløsninger på 5 %, 10 % og 20 % - med resultater på 0,127 J/g-K, 0,258 J/g-K og 0,516 J/g-K - i meget god overensstemmelse med en skalering af koncentrationen med en faktor 2, mens glasovergangstemperaturerne forbliver stort set konstante. Der er et lineært forhold mellem trinhøjden og koncentrationen (fig. 5).
Når koncentrationen af saccharoseopløsningerne stiger, forskydes starten på issmeltningen (ekstrapoleret begyndelsestemperatur) desuden til lavere værdier i figur 6. Ved højere koncentrationer resulterer dette i et lavere interval mellem glasovergangen for den maksimalt koncentrerede opløsning og starten på smeltningen af det frie vand.
Nogle amorfe stoffer krystalliserer igen ved opvarmning over glastemperaturen. Denne effekt, der kaldes devitrifikation eller koldkrystallisation, kan bruges til at ændre lyofilisatets porøsitet og restfugtighed [2] ved at temperere materialet over omkrystallisationstemperaturen (ekstrapoleret begyndelse). På grund af omkrystallisering sker der en faseseparation, og det "ufrosne" vand, der frigives, bliver til is. Som vist i figur 3 sker der dog ingen efterkrystallisation i tilfældet med saccharose.
Primær tørring
I dette trin fjernes den frosne is i et vakuum ved sublimering (overgang fra den faste til den gasformige aggregattilstand).
Under denne proces - hvor der tilføres varme udefra - må temperaturen i produktet ikke stige over glasovergangstemperaturen, da dette fører til blødgøring af rammestrukturen og kollaps af systemet [5]. Ødelæggelsen af rammestrukturen under tørringsfasen kaldes kollaps.
Selvom der rapporteres om kollapstemperaturer, der i gennemsnit er 1 til 5 K højere end de tilsvarende glasovergangstemperaturer [6], er glasovergangene for de maksimalt koncentrerede opløsninger, Tg´, som kan bestemmes ved hjælp af DSC, gode referencepunkter for deres position.
Sekundær tørring
I dette trin tørres produktet til det ønskede endelige fugtniveau ved at desorbere vandet i matricen via en langsom temperaturstigning.
I amorfe lyofilisater skal vandet diffundere fra den glasagtige fase til overfladen. Denne ret langsomme proces er årsagen til, at eftertørringstrinnet ofte er det, der bestemmer frysetørringshastigheden for amorfe lyofilisater [2].
På grund af vandets blødgørende effekt er den amorfe fases glasovergangstemperatur direkte relateret til det indesluttede vandindhold. Efterhånden som afvandingen skrider frem, stiger Tg (glasovergangen for saccharose som et fast stof); dens position kan også bestemmes hurtigt og præcist ved hjælp af DSC.
Konklusion
Væsentlige egenskaber for udformningen af den primære tørringsproces er glasovergangstemperaturen for den maksimalt koncentrerede opløsning (Tg´) og kollapstemperaturen, hvor materialet bliver blødt, så det ikke længere kan bære sin egen struktur og begynder at flyde. Ved hjælp af DSC (nogle gange som TM-DSC*) kan Tg´nemt bestemmes.
Kollapstemperaturen er lidt højere end Tg´; det nøjagtige interval mellem Tg´og kollapstemperaturen er formuleringsafhængigt.