Introdução
Lisozima, ou muramidase, é o nome de um grupo de enzimas que hidrolisa os peptidoglicanos, uma macromolécula estrutural composta de açúcares e aminoácidos, formando uma camada protetora na parede externa das células bacterianas. A lisozima é muito difundida na natureza, estando presente em animais, plantas, bactérias e também em vírus bacteriófagos. Ela faz parte do sistema imunológico inato que age contra a infecção bacteriana. Ela pode ser encontrada em secreções corporais, como saliva e lágrimas, tecidos e também em órgãos. Devido à sua atividade antibacteriana e antifúngica, a lisozima tem potencial para aplicações clínicas, em rações e alimentos [2]. Ela também é amplamente aplicada como molécula modelo para a investigação da estrutura, estabilidade e função da proteína em várias áreas de pesquisa [3].
A lisozima é uma small proteína globular com estrutura química semelhante nos diferentes seres vivos em que está presente, veja a figura 1. Os diferentes tipos de lisozimas são classificados em três famílias principais: tipo galinha, tipo ganso e tipo invertebrado. As lisozimas humanas e de galinha são classificadas como do tipo galinha e são quase 60% idênticas em sua sequência de aminoácidos, enquanto a lisozima de galinha é composta de 129 resíduos de aminoácidos (14,3 kDa), a lisozima humana tem 130 (14,7 kDa). A clara do ovo de galinha é a principal fonte comercial de lisozima [2,3]. A chamada lisozima de clara de ovo de galinha (HEWL) é ativa em uma large faixa de pH (6 - 9) e apresenta uma Temperaturas e entalpias de fusãoA entalpia de fusão de uma substância, também conhecida como calor latente, é uma medida da entrada de energia, normalmente calor, necessária para converter uma substância do estado sólido para o líquido. O ponto de fusão de uma substância é a temperatura na qual ela muda de estado, passando do sólido (cristalino) para o líquido (fusão isotrópica). temperatura de fusão/transição, Tm, de 72°C em pH 5,0 [4].
A DSC é amplamente aplicada para estudar a Estabilidade térmicaUm material é termicamente estável se ele não se decompõe sob a influência da temperatura. Uma maneira de determinar a estabilidade térmica de uma substância é usar um TGA (analisador termogravimétrico). estabilidade térmica de proteínas e formulações de proteínas. O desdobramento de uma proteína é um efeito EndotérmicoUma transição de amostra ou uma reação é endotérmica se for necessário calor para a conversão.endotérmico resultante da exposição de seus grupos hidrofóbicos ao meio aquoso medium. Portanto, para proteínas em soluções, um pico de absorção de calor é frequentemente observado na curva DSC, e seu pico máximo é referido na literatura como a Temperaturas e entalpias de fusãoA entalpia de fusão de uma substância, também conhecida como calor latente, é uma medida da entrada de energia, normalmente calor, necessária para converter uma substância do estado sólido para o líquido. O ponto de fusão de uma substância é a temperatura na qual ela muda de estado, passando do sólido (cristalino) para o líquido (fusão isotrópica). temperatura de fusão/transição (Tm). A desnaturação térmica (desdobramento da estrutura tridimensional da proteína) pode ser reversível ou irreversível, dependendo das características da proteína e das condições do medium, figura 2 [5]. Medium condições que influenciam a reversibilidade da desnaturação incluem, por exemplo, a concentração da proteína, o pH, a força Ionic e a temperatura. Portanto, espera-se que as alterações na estrutura da proteína ou na formulação medium possam influenciar a termoestabilidade das proteínas, o que se reflete no Tm medido.
A DSC mede diretamente a absorção de calor associada ao processo de desdobramento. É um método confiável para determinar as características termodinâmicas de uma proteína nativa para caracterizar proteínas que sofreram modificações estruturais ou para acessar a Estabilidade térmicaUm material é termicamente estável se ele não se decompõe sob a influência da temperatura. Uma maneira de determinar a estabilidade térmica de uma substância é usar um TGA (analisador termogravimétrico). estabilidade térmica de formulações de proteínas para uso terapêutico.
Experimental
Método de preparação de amostras
A lisozima1 foi solubilizada em água destilada e filtrada2 em concentrações de 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml e 5 mg/ml. 20 μl de cada concentração foram pipetados em cadinhos Concavus® 3 que foram imediatamente selados. Para a solução de 24 mg/ml, um volume de 5 μl também foi analisado. Foram realizadas pelo menos três medições em cada amostra. O cadinho de referência foi preenchido com o mesmo volume de água destilada e filtrada. As medições foram realizadas em uma atmosfera inerte (N2 dinâmico, 40 ml/min) a uma taxa de aquecimento de 10 K/min.
1 Lisozima de clara de ovo de galinha, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizada, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtro de membrana de polietersulfona - PES, 450 μm
3 Concavus® Cadinhos de alumínio de 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Resultados de medição e discussão
As curvas DSC das soluções aquosas de lisozima mostram o efeito EndotérmicoUma transição de amostra ou uma reação é endotérmica se for necessário calor para a conversão.endotérmico único típico na faixa de 75 °C para todas as concentrações medidas. A Figura 3 mostra curvas típicas de soluções em concentrações de 300, 200 e 20 mg/ml. A temperatura de início extrapolada, a temperatura de pico (Tm) e a área sob a curva (entalpia) variam com a concentração. Quanto maior a massa da amostra no cadinho, mais amplo é o efeito EndotérmicoUma transição de amostra ou uma reação é endotérmica se for necessário calor para a conversão.endotérmico. O efeito de ampliação é observado durante a variação das temperaturas extrapoladas de início e de pico, bem como da entalpia. As concentrações escolhidas são representativas de medicamentos proteicos terapêuticos comuns, que geralmente são altamente concentrados, com a dosagem de proteína dada em mg/kg de peso corporal. A Figura 4 mostra a influência do volume da amostra exibindo as curvas de DSC de soluções a 20 mg/ml (5 μl) e a 5 mg/ml (20 μl).
As respectivas massas foram de 0,13 mg e 0,10 mg. Os resultados de todas as medições estão resumidos na tabela 1.
Tabela 1: Caracterização da lisozima por meio de DSC: concentração, massa da proteína, volumes das amostras medidas e as respectivas temperaturas de transição (picos) e entalpias (áreas)
Concentração (mg/ml) | Volume da amostra (μl) | Concentração (mM) | Massa da proteína (mg) | Área (J/g) | Pico (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Resumo
Neste estudo, o DSC 300 Caliris® foi usado para investigar a temperatura de transição da lisozima em uma ampla faixa de concentrações, de 5 a 300 mg/ml, que é representativa das formulações de proteínas disponíveis comercialmente. Embora tenham sido usadas soluções de alta concentração, a medição em volumes tão small quanto 5 μl permitiu economizar as formulações caras com alta reprodutibilidade.
small A sensibilidade do sensor e a possibilidade de usar volumes na faixa de alguns microlitros, juntamente com a possibilidade de ter um trocador de amostras automatizado, fazem da DSC uma técnica valiosa para a análise de biomoléculas. Dependendo da taxa de aquecimento/resfriamento, o rendimento pode chegar a 3 amostras por hora.