Wprowadzenie
Lizozym lub muramidaza to nazwa grupy enzymów, które hydrolizują peptydoglikany, makrocząsteczki strukturalne złożone z cukrów i aminokwasów, tworzące warstwę ochronną na zewnętrznej ścianie komórek bakteryjnych. Lizozym jest szeroko rozpowszechniony w przyrodzie, występując u zwierząt, roślin, bakterii, a także w wirusach bakteriofagowych. Jest częścią wrodzonego układu odpornościowego działającego przeciwko infekcjom bakteryjnym. Można go znaleźć w wydzielinach ciała, takich jak ślina i łzy, tkankach, a także w narządach. Ze względu na swoją aktywność przeciwbakteryjną i przeciwgrzybiczą lizozym ma potencjał w zastosowaniach klinicznych, paszowych i spożywczych [2]. Jest również szeroko stosowany jako cząsteczka modelowa do badania struktury, stabilności i funkcji białek w kilku obszarach badawczych [3].
Lizozym jest białkiem kulistym small o podobnej strukturze chemicznej u różnych istot żywych, w których występuje, patrz rysunek 1. Różne typy lizozymów są podzielone na trzy główne rodziny: typ kurzy, typ gęsi i typ bezkręgowców. Lizozymy ludzkie i kurze są klasyfikowane jako typ kurzy i są prawie w 60% identyczne pod względem sekwencji aminokwasów, podczas gdy lizozym kurzy składa się ze 129 reszt aminokwasowych (14,3 kDa), lizozym ludzki ma 130 (14,7 kDa). Białko jaja kurzego jest głównym komercyjnym źródłem lizozymu [2,3]. Tak zwany lizozym z białka jaja kurzego (HEWL) jest aktywny w zakresie pH large (6 - 9) i reprezentuje temperaturę topnienia/transmisji, Tm, 72°C przy pH 5,0 [4].
DSC jest w dużej mierze stosowana do badania stabilności termicznej białek i preparatów białkowych. Rozwijanie białka jest efektem endotermicznym wynikającym z ekspozycji jego grup hydrofobowych na działanie wody medium. Dlatego w przypadku białek w roztworach często obserwuje się pik absorpcji ciepła na krzywej DSC, a jego maksimum jest określane w literaturze jako Temperatury i entalpie topnieniaEntalpia syntezy substancji, znana również jako ciepło utajone, jest miarą nakładu energii, zazwyczaj ciepła, która jest niezbędna do przekształcenia substancji ze stanu stałego w ciekły. Temperatura topnienia substancji to temperatura, w której zmienia ona stan ze stałego (krystalicznego) na ciekły (stopiony izotropowo).temperatura topnienia/transformacji (Tm). Denaturacja termiczna (rozłożenie trójwymiarowej struktury białka) może być odwracalna lub nieodwracalna, w zależności od charakterystyki białka i warunków medium, rysunek 2 [5]. Medium warunki, które wpływają na odwracalność denaturacji obejmują, na przykład, stężenie białka, pH, Ionic siłę i temperaturę. Oczekuje się zatem, że zmiany w strukturze białka lub w formulacji medium mogą wpływać na termostabilność białek, co znajduje odzwierciedlenie w zmierzonej Tm.
DSC mierzy bezpośrednio absorpcję ciepła związaną z procesem rozwijania. Jest to niezawodna metoda określania właściwości termodynamicznych natywnego białka w celu scharakteryzowania białek poddanych modyfikacjom strukturalnym lub w celu uzyskania dostępu do stabilności termicznej preparatów białkowych do użytku terapeutycznego.
Eksperymentalny
Metoda przygotowania próbki
Lizozym1 rozpuszczono w wodzie destylowanej i przefiltrowanej2 w stężeniach 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml i 5 mg/ml. 20 μl każdego stężenia zostało odpipetowane do tygli Concavus® 3, które zostały natychmiast zapieczętowane. W przypadku roztworu o stężeniu 24 mg/ml analizowano również objętość 5 μl. Przeprowadzono co najmniej trzy pomiary dla każdej próbki. Tygiel referencyjny został wypełniony taką samą objętością destylowanej przefiltrowanej wody. Pomiary przeprowadzono w atmosferze obojętnej (dynamiczny N2, 40 ml/min) przy szybkości ogrzewania 10 K/min.
1 Lizozym z białka jaja kurzego, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizowany, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtr membranowy z polieterosulfonu - PES, 450 μm
3 Tygle aluminiowe Concavus® 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Wyniki pomiarów i dyskusja
Krzywe DSC wodnych roztworów lizozymu wykazują typowy pojedynczy efekt EndotermicznyPrzemiana próbki lub reakcja jest endotermiczna, jeśli do konwersji potrzebne jest ciepło.endotermiczny w zakresie 75°C dla wszystkich mierzonych stężeń. Rysunek 3 przedstawia typowe krzywe dla roztworów o stężeniach 300, 200 i 20 mg/ml. Ekstrapolowana temperatura początku, temperatura szczytowa (Tm) i pole pod krzywą (entalpia) zmieniają się w zależności od stężenia. Im większa masa próbki w tyglu, tym szerszy efekt EndotermicznyPrzemiana próbki lub reakcja jest endotermiczna, jeśli do konwersji potrzebne jest ciepło.endotermiczny. Efekt poszerzenia jest obserwowany podczas zmiany ekstrapolowanych temperatur początkowych i szczytowych, a także entalpii. Wybrane stężenia są reprezentatywne dla zwykłych terapeutycznych leków białkowych, które są zwykle wysoce skoncentrowane, z dawką białka podaną w mg/kg masy ciała. Rysunek 4 pokazuje wpływ objętości próbki poprzez wyświetlenie krzywych DSC roztworów o stężeniu 20 mg/ml (5 μl) i 5 mg/ml (20 μl).
Odpowiednie masy wynosiły 0,13 mg i 0,10 mg. Wyniki wszystkich pomiarów podsumowano w tabeli 1.
Tabela 1: Charakterystyka lizozymu za pomocą DSC: stężenie, masa białka, objętości mierzonych próbek oraz odpowiednie temperatury przejścia (piki) i entalpie (obszary)
Stężenie (mg/ml) | Objętość próbki (μl) | Stężenie (mM) | Masa białka (mg) | Obszar (J/g) | Szczyt (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Podsumowanie
W tym badaniu DSC 300 Caliris® został użyty do zbadania temperatury przejścia lizozymu w szerokim zakresie stężeń, od 5 do 300 mg/ml, co jest reprezentatywne dla komercyjnie dostępnych preparatów białkowych. Chociaż zastosowano roztwory o wysokim stężeniu, pomiar na objętościach tak small jak 5 μl pozwolił na zaoszczędzenie drogich preparatów przy zachowaniu wysokiej powtarzalności.
Czułość czujnika i możliwość stosowania objętości small w zakresie kilku mikrolitrów, wraz z możliwością posiadania automatycznego podajnika próbek, sprawiają, że DSC jest cenną techniką analizy biomolekuł. W zależności od szybkości ogrzewania/chłodzenia, przepustowość może wynosić nawet 3 próbki na godzinę.