Inleiding
Lysozym of muramidase is de naam van een groep enzymen die de peptidoglycanen hydrolyseren, een structureel macromolecuul dat bestaat uit suikers en aminozuren en dat een beschermende laag vormt op de buitenwand van bacteriële cellen. Lysozym is wijdverspreid in de natuur en komt voor in dieren, planten, bacteriën en ook in bacteriofaagvirussen. Het maakt deel uit van het aangeboren immuunsysteem dat optreedt tegen bacteriële infectie. Het komt voor in lichaamssecreties zoals speeksel en tranen, weefsels en ook in organen. Vanwege de antibacteriële en schimmelwerende activiteit heeft lysozym een potentieel in klinische, diervoeder- en voedingstoepassingen [2]. Het wordt ook op grote schaal toegepast als een modelmolecuul voor het onderzoeken van de eiwitstructuur, -stabiliteit en -functie in verschillende onderzoeksgebieden [3].
Lysozym is een small bolvormig eiwit met een vergelijkbare chemische structuur in de verschillende levende wezens waarin het aanwezig is, zie figuur 1. De verschillende typen lysozymes worden ingedeeld in drie hoofdfamilies: kippentype, ganzentype en ongewerveld-type. Menselijke en kippenlysozymes worden geclassificeerd als kippentype en zijn bijna 60% identiek in hun aminozuursequentie, terwijl kippenlysozym is samengesteld uit 129 aminozuurresiduen (14,3 kDa), menselijk lysozym heeft er 130 (14,7 kDa). Kippenei-eiwit is de belangrijkste commerciële bron van lysozym [2,3]. Het zogenaamde kippenei-eiwitlysozym (HEWL) is actief in een large bereik van pH (6 - 9) en heeft een smelt/overgangstemperatuur, Tm, van 72°C bij pH 5,0 [4].
DSC wordt veel toegepast om de Thermische stabiliteitEen materiaal is thermisch stabiel als het niet ontleedt onder invloed van temperatuur. Een manier om de thermische stabiliteit van een stof te bepalen is door een TGA (thermogravimetrische analyser) te gebruiken. thermische stabiliteit van eiwitten en eiwitformules te bestuderen. Het ontvouwen van een eiwit is een EndothermEen monsterovergang of reactie is endotherm als er warmte nodig is voor de omzetting.endotherm effect dat ontstaat door de blootstelling van de hydrofobe groepen aan het water medium. Daarom wordt voor eiwitten in oplossingen vaak een warmteabsorptiepiek waargenomen in de DSC-curve en wordt het piekmaximum in de literatuur de smelt/overgangstemperatuur (Tm) genoemd. De thermische denaturatie (ontvouwen van de 3-dimensionale structuur van het eiwit) kan reversibel of irreversibel zijn, afhankelijk van de eiwitkarakteristieken en de condities van de medium, figuur 2 [5]. Medium condities die de reversibiliteit van de denaturatie beïnvloeden zijn bijvoorbeeld de eiwitconcentratie, pH, Ionic sterkte en temperatuur. Daarom wordt verwacht dat veranderingen in de eiwitstructuur of in de formulering medium de thermostabiliteit van eiwitten kunnen beïnvloeden, wat tot uitdrukking komt in de gemeten Tm.
DSC meet rechtstreeks de warmteabsorptie die gepaard gaat met het ontvouwingsproces. Het is een betrouwbare methode voor het bepalen van de thermodynamische eigenschappen van een natief eiwit om eiwitten te karakteriseren die structurele modificaties hebben ondergaan of om toegang te krijgen tot de Thermische stabiliteitEen materiaal is thermisch stabiel als het niet ontleedt onder invloed van temperatuur. Een manier om de thermische stabiliteit van een stof te bepalen is door een TGA (thermogravimetrische analyser) te gebruiken. thermische stabiliteit van eiwitformuleringen voor therapeutisch gebruik.
Experimenteel
Monsterbereidingsmethode
Lysozym1 werd opgelost in gedestilleerd en gefiltreerd2 water in concentraties van 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml en 5 mg/ml. 20 μl van elke concentratie werd gepipetteerd in Concavus®kroezen3 die onmiddellijk werden afgesloten. Voor de oplossing van 24 mg/ml werd ook een volume van 5 μl geanalyseerd. Op elk monster werden ten minste drie metingen uitgevoerd. De referentiekroes werd gevuld met hetzelfde volume gedestilleerd gefilterd water. De metingen werden uitgevoerd onder een inerte atmosfeer (dynamische N2, 40 ml/min) bij een verwarmingssnelheid van 10 K/min.
1 Kippenei-eiwitlysozym, ≥ 45 000 FIP U/mg, gevriesdroogd, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyethersulfon - PES-membraanfilter, 450 μm
3 Concavus® 40 μl aluminiumkroezen, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Meetresultaten en discussie
De DSC-curves van lysozym-waterige oplossingen vertonen het typische enkelvoudige endotherme effect in het bereik van 75 °C voor alle gemeten concentraties. Figuur 3 toont typische curven van oplossingen bij concentraties van 300, 200 en 20 mg/ml. De geëxtrapoleerde begintemperatuur, piektemperatuur (Tm) en oppervlakte onder de curve (enthalpie) variëren met de concentratie. Hoe hoger de massa van het monster in de kroes, hoe breder het endotherme effect. Het verbredingseffect wordt waargenomen bij variatie van de geëxtrapoleerde begin- en piektemperatuur en de enthalpie. De gekozen concentraties zijn representatief voor gewone therapeutische eiwitmedicijnen, die meestal sterk geconcentreerd zijn, waarbij de eiwitdosering is gegeven in mg/kg lichaamsgewicht. Figuur 4 toont de invloed van het monstervolume door de DSC-curves weer te geven van oplossingen met 20 mg/ml (5 μl) en met 5 mg/ml (20 μl).
De respectieve massa's waren 0,13 mg en 0,10 mg. De resultaten van alle metingen zijn samengevat in tabel 1.
Tabel 1: Karakterisering van lysozym met behulp van DSC: concentratie, eiwitmassa, volumes van gemeten monsters en de respectieve overgangstemperaturen (pieken) en enthalpie (gebieden)
Concentratie (mg/ml) | Monstervolume (μl) | Concentratie (mM) | Eiwitmassa (mg) | Gebied (J/g) | Piek (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Samenvatting
In dit onderzoek werd de DSC 300 Caliris® gebruikt om de overgangstemperatuur van lysozym te onderzoeken in een breed concentratiebereik, van 5 tot 300 mg/ml, wat representatief is voor commercieel verkrijgbare eiwitformuleringen. Hoewel er oplossingen met een hoge concentratie werden gebruikt, konden de dure formuleringen met een hoge reproduceerbaarheid worden bespaard door metingen uit te voeren op volumes van small tot 5 μl.
De gevoeligheid van de sensor en de mogelijkheid om small volumes van enkele microliters te gebruiken, samen met de mogelijkheid van een geautomatiseerde monsterwisselaar, maken DSC een waardevolle techniek voor de analyse van biomoleculen. Afhankelijk van de verwarmings-/koelsnelheid kan de verwerkingscapaciteit oplopen tot 3 monsters per uur.