Introducere
Lizozima sau muramidaza este denumirea unui grup de enzime care hidrolizează peptidoglicanii, o macromoleculă structurală compusă din zaharuri și aminoacizi, care formează un strat protector pe peretele extern al celulelor bacteriene. Lizozima este larg răspândită în natură, fiind prezentă la animale, plante, bacterii și, de asemenea, în virușii bacteriofagi. Face parte din sistemul imunitar înnăscut care acționează împotriva infecțiilor bacteriene. Se găsește în secrețiile corpului, cum ar fi saliva și lacrimile, în țesuturi și în organe. Datorită activității sale antibacteriene și antifungice, lizozima are un potențial în aplicații clinice, furajere și alimentare [2]. De asemenea, este aplicată pe scară largă ca moleculă model pentru investigarea structurii, stabilității și funcției proteinelor în mai multe domenii de cercetare [3].
Lizozima este o proteină globulară small cu o structură chimică similară în diferitele ființe vii în care este prezentă, a se vedea figura 1. Diferitele tipuri de lizozime sunt clasificate în trei familii principale: tip pui, tip gâscă și tip nevertebrat. Lizozimele umane și cele de pui sunt clasificate ca fiind de tip pui și sunt identice în proporție de aproape 60% în ceea ce privește secvența de aminoacizi, în timp ce lizozima de pui este compusă din 129 de reziduuri de aminoacizi (14,3 kDa), lizozima umană are 130 (14,7 kDa). Albușul de ou de găină este principala sursă comercială de lizozimă [2,3]. Așa-numita lizozimă din albuș de ou de găină (HEWL) este activă într-un interval large de pH (6 - 9) și reprezintă o Temperaturile și entalpiile de topireEntalpia de fuziune a unei substanțe, cunoscută și sub denumirea de căldură latentă, este o măsură a aportului de energie, de obicei căldură, care este necesară pentru a transforma o substanță din stare solidă în stare lichidă. Punctul de topire al unei substanțe este temperatura la care aceasta își schimbă starea din solid (cristalin) în lichid (topitură izotropică). temperatură de topire/tranziție, Tm, de 72°C la pH 5,0 [4].
DSC este aplicată în mare măsură pentru a studia stabilitatea termică a proteinelor și a formulărilor proteice. Desfășurarea unei proteine este un efect EndotermiceO tranziție de probă sau o reacție este endotermă dacă este nevoie de căldură pentru conversie.endotermic care rezultă din expunerea grupărilor sale hidrofobe la soluția apoasă medium. Prin urmare, pentru proteinele în soluții, se observă adesea un vârf de absorbție a căldurii în curba DSC, iar maximul său este denumit în literatura de specialitate temperatura de Temperaturile și entalpiile de topireEntalpia de fuziune a unei substanțe, cunoscută și sub denumirea de căldură latentă, este o măsură a aportului de energie, de obicei căldură, care este necesară pentru a transforma o substanță din stare solidă în stare lichidă. Punctul de topire al unei substanțe este temperatura la care aceasta își schimbă starea din solid (cristalin) în lichid (topitură izotropică). topire/tranziție (Tm). Denaturarea termică (desfășurarea structurii tridimensionale a proteinei) poate fi reversibilă sau ireversibilă, în funcție de caracteristicile proteinei și de condițiile medium, figura 2 [5]. Medium Condițiile care influențează reversibilitatea denaturării includ, de exemplu, concentrația proteinei, pH-ul, rezistența Ionic și temperatura. Prin urmare, este de așteptat ca modificările în structura proteinei sau în formularea medium să poată influența termostabilitatea proteinelor, care se reflectă în Tm măsurată.
DSC măsoară direct absorbția de căldură asociată cu procesul de desfășurare. Este o metodă fiabilă de determinare a caracteristicilor termodinamice ale unei proteine native pentru a caracteriza proteinele care au suferit modificări structurale sau pentru a accesa stabilitatea termică a formulărilor proteice pentru uz terapeutic.
Experimental
Metoda de preparare a probelor
Lizozima1 a fost solubilizată în apă distilată și filtrată2 la concentrații de 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml și 5 mg/ml. 20 μl din fiecare concentrație au fost pipetăriți în creuzete3 Concavus® care au fost imediat sigilate. Pentru soluția la 24 mg/ml, a fost analizat și un volum de 5 μl. Au fost efectuate cel puțin trei măsurători pe fiecare probă. Creuzetul de referință a fost umplut cu același volum de apă distilată filtrată. Măsurătorile au fost efectuate într-o atmosferă inertă (N2 dinamic, 40 ml/min) la o rată de încălzire de 10 K/min.
1 Lizozimă din albuș de ou de găină, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizată, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtru cu membrană din polieter sulfonă - PES, 450 μm
3 Concavus® Creuzete din aluminiu de 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Rezultatele măsurătorilor și discuții
Curbele DSC ale soluțiilor apoase de lizozimă prezintă efectul EndotermiceO tranziție de probă sau o reacție este endotermă dacă este nevoie de căldură pentru conversie.endotermic unic tipic în intervalul de 75°C pentru toate concentrațiile măsurate. Figura 3 prezintă curbele tipice ale soluțiilor la concentrații de 300, 200 și 20 mg/ml. Temperatura de debut extrapolată, temperatura de vârf (Tm) și aria de sub curbă (entalpia) variază în funcție de concentrație. Cu cât masa probei din creuzet este mai mare, cu atât efectul EndotermiceO tranziție de probă sau o reacție este endotermă dacă este nevoie de căldură pentru conversie.endotermic este mai larg. Efectul de extindere se observă în timpul variației temperaturilor de debut și de vârf extrapolate, precum și a entalpiei. Concentrațiile alese sunt reprezentative pentru medicamentele proteice terapeutice obișnuite, care sunt de obicei foarte concentrate, doza proteică fiind dată în mg/kg de greutate corporală. Figura 4 arată influența volumului probei prin afișarea curbelor DSC ale soluțiilor la 20 mg/ml (5 μl) și la 5 mg/ml (20 μl).
Masele respective au fost de 0,13 mg și 0,10 mg. Rezultatele tuturor măsurătorilor sunt rezumate în tabelul 1.
Tabelul 1: Caracterizarea lizozimei cu ajutorul DSC: concentrația, masa proteinei, volumele probelor măsurate și temperaturile de tranziție (vârfurile) și entalpiile (zonele) respective
Concentrație (mg/ml) | Volumul probei (μl) | Concentrație (mM) | Masa proteinei (mg) | Suprafața (J/g) | Vârf (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Rezumat
În acest studiu, DSC 300 Caliris® a fost utilizat pentru a investiga temperatura de tranziție a lizozimei într-o gamă largă de concentrații, de la 5 la 300 mg/ml, care este reprezentativă pentru formulările de proteine disponibile în comerț. Deși au fost utilizate soluții cu concentrații ridicate, măsurarea pe volume de la small la 5 μl a permis economisirea formulărilor costisitoare cu o reproductibilitate ridicată.
Sensibilitatea senzorului și posibilitatea de a utiliza small volume de ordinul câtorva microlitri, împreună cu posibilitatea de a avea un schimbător automat de probe, fac din DSC o tehnică valoroasă pentru analiza biomoleculelor. În funcție de rata de încălzire/răcire, randamentul poate ajunge până la 3 probe pe oră.