Introducción
Lisozima, o muramidasa, es el nombre de un grupo de enzimas que hidrolizan los peptidoglicanos, una macromolécula estructural compuesta de azúcares y aminoácidos, que forma una capa protectora en la pared externa de las células bacterianas. La lisozima está muy extendida en la naturaleza, ya que está presente en animales, plantas, bacterias y también en virus bacteriófagos. Forma parte del sistema inmunitario innato que actúa contra la infección bacteriana. Se puede encontrar en secreciones corporales como la saliva y las lágrimas, en tejidos y también en órganos. Debido a su actividad antibacteriana y antifúngica, la lisozima tiene potencial en aplicaciones clínicas, alimentarias y en piensos [2]. También se aplica ampliamente como molécula modelo para la investigación de la estructura, estabilidad y función de las proteínas en varias áreas de investigación [3].
La lisozima es una proteína globular small con una estructura química similar en los distintos seres vivos en los que está presente, véase la figura 1. Los diferentes tipos de lisozimas se clasifican en tres familias principales: tipo pollo, tipo ganso y tipo invertebrado. Las lisozimas humana y de pollo se clasifican como de tipo pollo y son casi un 60% idénticas en su secuencia de aminoácidos, mientras que la lisozima de pollo está compuesta por 129 residuos de aminoácidos (14,3 kDa), la humana tiene 130 (14,7 kDa). La clara de huevo de gallina es la principal fuente comercial de lisozima [2,3]. La denominada lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) es activa en un rango large de pH (6 - 9) y presenta una Temperaturas y entalpías de fusiónLa entalpía de fusión de una sustancia, también conocida como calor latente, es una medida del aporte de energía, normalmente calor, que es necesario para convertir una sustancia del estado sólido al líquido. El punto de fusión de una sustancia es la temperatura a la que cambia de estado sólido (cristalino) a líquido (fusión isotrópica).temperatura de fusión/transición, Tm, de 72°C a pH 5,0 [4].
El DSC se aplica en gran medida para estudiar la Estabilidad térmicaUn material es térmicamente estable si no se descompone bajo la influencia de la temperatura. Una forma de determinar la estabilidad térmica de una sustancia es utilizar un TGA (analizador termogravimétrico). estabilidad térmica de proteínas y formulaciones proteicas. El desdoblamiento de una proteína es un efecto EndotérmicoUna transición de muestra o una reacción es endotérmica si se necesita calor para la conversión.endotérmico resultante de la exposición de sus grupos hidrófobos al medio acuoso medium. Por lo tanto, para las proteínas en soluciones, a menudo se observa un pico de absorción de calor en la curva DSC, y su pico máximo se denomina en la bibliografía Temperaturas y entalpías de fusiónLa entalpía de fusión de una sustancia, también conocida como calor latente, es una medida del aporte de energía, normalmente calor, que es necesario para convertir una sustancia del estado sólido al líquido. El punto de fusión de una sustancia es la temperatura a la que cambia de estado sólido (cristalino) a líquido (fusión isotrópica).temperatura de fusión/transición (Tm). La desnaturalización térmica (desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína) puede ser reversible o irreversible, dependiendo de las características de la proteína y de las condiciones de la medium, figura 2 [5]. Medium condiciones que influyen en la reversibilidad de la desnaturalización incluyen, por ejemplo, la concentración de proteína, el pH, la fuerza Ionic y la temperatura. Por lo tanto, se espera que los cambios en la estructura de la proteína o en la formulación medium puedan influir en la termoestabilidad de las proteínas, lo que se refleja en la Tm medida.
La DSC mide directamente la absorción de calor asociada al proceso de desdoblamiento. Es un método fiable para determinar las características termodinámicas de una proteína nativa para caracterizar proteínas que sufrieron modificaciones estructurales o para acceder a la Estabilidad térmicaUn material es térmicamente estable si no se descompone bajo la influencia de la temperatura. Una forma de determinar la estabilidad térmica de una sustancia es utilizar un TGA (analizador termogravimétrico). estabilidad térmica de formulaciones proteicas para uso terapéutico.
Experimental
Método de preparación de muestras
La lisozima1 se solubilizó en agua destilada y filtrada2 en concentraciones de 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml y 5 mg/ml. se pipetearon 20 μl de cada concentración en crisoles Concavus® 3 que se sellaron inmediatamente. Para la solución a 24 mg/ml, también se analizó un volumen de 5 μl. Se realizaron al menos tres mediciones de cada muestra. El crisol de referencia se llenó con el mismo volumen de agua destilada filtrada. Las mediciones se realizaron en atmósfera inerte (N2 dinámico, 40 ml/min) a una velocidad de calentamiento de 10 K/min.
1 Lisozima de clara de huevo de gallina, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizada, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtro de membrana de poliéter sulfona - PES, 450 μm
3 Concavus® Crisoles de aluminio de 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Resultados de las mediciones y discusión
Las curvas DSC de las soluciones acuosas de lisozima muestran el típico efecto EndotérmicoUna transición de muestra o una reacción es endotérmica si se necesita calor para la conversión.endotérmico único en el rango de 75°C para todas las concentraciones medidas. La Figura 3 muestra curvas típicas de soluciones a concentraciones de 300, 200 y 20 mg/ml. La temperatura de inicio extrapolada, la temperatura de pico (Tm) y el área bajo la curva (entalpía) varían con la concentración. Cuanto mayor es la masa de la muestra en el crisol, más amplio es el efecto EndotérmicoUna transición de muestra o una reacción es endotérmica si se necesita calor para la conversión.endotérmico. El efecto de ensanchamiento se observa durante la variación de las temperaturas de inicio y de pico extrapoladas, así como de la entalpía. Las concentraciones elegidas son representativas de los fármacos proteicos terapéuticos ordinarios, que suelen estar muy concentrados, y la dosis de proteína se indica en mg/kg de peso corporal. La figura 4 muestra la influencia del volumen de la muestra mostrando las curvas DSC de soluciones a 20 mg/ml (5 μl) y a 5 mg/ml (20 μl).
Las masas respectivas fueron de 0,13 mg y 0,10 mg. Los resultados de todas las mediciones se resumen en la tabla 1.
Tabla 1: Caracterización de la lisozima mediante DSC: concentración, masa proteica, volúmenes de las muestras medidas y las respectivas temperaturas de transición (picos) y entalpías (áreas)
Concentración (mg/ml) | Volumen de la muestra (μl) | Concentración (mM) | Masa de proteína (mg) | Área (J/g) | Pico (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Resumen
En este estudio, se utilizó el DSC 300 Caliris® para investigar la temperatura de transición de la lisozima en una amplia gama de concentraciones, de 5 a 300 mg/ml, que es representativa de las formulaciones de proteínas disponibles en el mercado. Aunque se utilizaron soluciones de alta concentración, la medición en volúmenes de tan solo small como 5 μl permitió ahorrar las costosas formulaciones con una alta reproducibilidad.
La sensibilidad del sensor y la posibilidad de utilizar volúmenes de small en el rango de unos pocos microlitros, junto con la posibilidad de disponer de un cambiador de muestras automatizado, hacen del DSC una técnica valiosa para el análisis de biomoléculas. Dependiendo de la velocidad de calentamiento/enfriamiento, el rendimiento puede llegar a 3 muestras por hora.