Johdanto
Lysotsyymi eli muramidaasi on nimi entsyymiryhmälle, joka hydrolysoi peptidoglykaanit, sokereista ja aminohapoista koostuvan rakenteellisen makromolekyylin, joka muodostaa bakteerisolujen ulkoseinän suojakerroksen. Lysotsyymi on luonnossa laajalle levinnyt, sillä sitä esiintyy eläimissä, kasveissa, bakteereissa ja myös bakteriofagiviruksissa. Se on osa synnynnäistä immuunijärjestelmää, joka toimii bakteeri-infektioita vastaan. Sitä esiintyy kehon eritteissä, kuten syljessä ja kyynelissä, kudoksissa ja myös elimissä. Antibakteeri- ja antifungaalisen aktiivisuutensa ansiosta lysotsyymillä on potentiaalia kliinisissä, rehu- ja elintarvikesovelluksissa [2]. Sitä käytetään myös laajalti mallimolekyylinä proteiinien rakenteen, stabiilisuuden ja toiminnan tutkimiseen useilla tutkimusaloilla [3].
Lysotsyymi on small pallomainen proteiini, jolla on samanlainen kemiallinen rakenne eri elävissä olennoissa, joissa sitä esiintyy, ks. kuva 1. Lysotsyymien eri tyypit luokitellaan kolmeen pääperheeseen: kanatyyppi, hanhityyppi ja selkärangattomat-tyyppi. Ihmisen ja kanan lysotsyymit luokitellaan kanatyyppisiksi, ja niiden aminohapposekvenssi on lähes 60-prosenttisesti identtinen, mutta kanan lysotsyymi koostuu 129 aminohappojäännöksestä (14,3 kDa), kun taas ihmisen lysotsyymissä on 130 aminohappojäännöstä (14,7 kDa). Kananmunan valkuainen on tärkein kaupallinen lysotsyymin lähde [2,3]. Niin kutsuttu kananmunan valkuaisen lysotsyymi (HEWL) on aktiivinen large pH-alueella (6-9), ja sen sulamis-/siirtymislämpötila, Tm, on 72 °C pH:ssa 5,0 [4].
DSC:tä käytetään laajalti proteiinien ja proteiinivalmisteiden lämpöstabiilisuuden tutkimiseen. Proteiinin taittuminen on EndoterminenNäytteen siirtyminen tai reaktio on endoterminen, jos muuntumiseen tarvitaan lämpöä.endoterminen vaikutus, joka johtuu proteiinin hydrofobisten ryhmien altistumisesta vesipitoiseen medium. Tämän vuoksi DSC-käyrässä havaitaan usein lämpöabsorptiohuippu liuoksissa oleville proteiineille, ja sen maksimiin viitataan kirjallisuudessa sulamis-/siirtymislämpötilana (Tm). Terminen denaturaatio (proteiinin kolmiulotteisen rakenteen avautuminen) voi olla palautuvaa tai palautumatonta riippuen proteiinin ominaisuuksista ja olosuhteista medium, kuva 2 [5]. Medium Denaturaation palautuvuuteen vaikuttavia olosuhteita ovat esimerkiksi proteiinin konsentraatio, pH, Ionic vahvuus ja lämpötila. Siksi on odotettavissa, että muutokset proteiinin rakenteessa tai formulaatiossa medium voivat vaikuttaa proteiinien termostabiilisuuteen, mikä näkyy mitatussa Tm:ssä.
DSC mittaa suoraan taittumisprosessiin liittyvää lämpöabsorptiota. Se on luotettava menetelmä natiiviproteiinin termodynaamisten ominaisuuksien määrittämiseksi, jotta voidaan luonnehtia proteiineja, joihin on tehty rakenteellisia muutoksia, tai jotta voidaan selvittää terapeuttiseen käyttöön tarkoitettujen proteiinivalmisteiden LämpöstabiilisuusMateriaali on lämpöstabiili, jos se ei hajoa lämpötilan vaikutuksesta. Yksi tapa määrittää aineen lämpöstabiilisuus on käyttää TGA-analysaattoria (termogravimetrinen analysaattori). lämpöstabiilisuus.
Kokeellinen
Näytteen valmistusmenetelmä
Lysotsyymi1 liuotettiin tislattuun ja suodatettuun2 veteen pitoisuuksina 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml ja 5 mg/ml. kustakin pitoisuudesta pipetoitiin 20 μl Concavus®upokkaisiin3, jotka suljettiin välittömästi. Myös 24 mg/ml:n liuoksesta analysoitiin 5 μl. Kullekin näytteelle tehtiin vähintään kolme mittausta. Vertailuastia täytettiin samalla määrällä tislattua suodatettua vettä. Mittaukset suoritettiin inertissä ilmakehässä (dynaaminen N2, 40 ml/min) lämmitysnopeudella 10 K/min.
1 Kananmunan valkuainen lysotsyymi, ≥ 45 000 FIP U/mg, lyofilisoitu, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyeetterisulfon - PES-membraanisuodatin, 450 μm
3 Concavus® 40 μl alumiiniset upokkaat, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Mittaustulokset ja keskustelu
Lysotsyymin vesiliuosten DSC-käyrät osoittavat tyypillistä yksittäistä endotermistä vaikutusta 75 °C:n alueella kaikilla mitatuilla pitoisuuksilla. Kuvassa 3 esitetään tyypilliset käyrät liuoksille, joiden pitoisuudet ovat 300, 200 ja 20 mg/ml. Ekstrapoloitu alkamislämpötila, huippulämpötila (Tm) ja käyrän alle jäävä pinta-ala (entalpia) vaihtelevat pitoisuuden mukaan. Mitä suurempi massanäyte on upokkaassa, sitä laajempi on EndoterminenNäytteen siirtyminen tai reaktio on endoterminen, jos muuntumiseen tarvitaan lämpöä.endoterminen vaikutus. Laajeneva vaikutus havaitaan ekstrapoloitujen alkamis- ja huippulämpötilojen sekä entalpian vaihtelun aikana. Valitut pitoisuudet edustavat tavanomaisia terapeuttisia proteiinilääkkeitä, jotka ovat tavallisesti erittäin väkeviä, ja proteiiniannos on ilmoitettu milligrammoina kehon painokiloa kohti. Kuvassa 4 osoitetaan näytetilavuuden vaikutus esittämällä 20 mg/ml (5 μl) ja 5 mg/ml (20 μl) liuosten DSC-käyrät.
Vastaavat massat olivat 0,13 mg ja 0,10 mg. Kaikkien mittausten tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 1.
Taulukko 1: Lysotsyymin karakterisointi DSC:n avulla: konsentraatio, proteiinimassa, mitattujen näytteiden tilavuudet ja vastaavat siirtymälämpötilat (piikit) ja entalpiat (pinta-alat)
Konsentraatio (mg/ml) | Näytteen tilavuus (μl) | Konsentraatio (mM) | Proteiinin massa (mg) | Pinta-ala (J/g) | Huippu (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Yhteenveto
Tässä tutkimuksessa käytettiin DSC 300 Caliris® -laitetta lysotsyymin siirtymislämpötilan tutkimiseen laajalla pitoisuusalueella, joka on 5-300 mg/ml, mikä edustaa kaupallisesti saatavilla olevia proteiinivalmisteita. Vaikka käytettiin suurikonsentraattisia liuoksia, mittaukset niinkin suurilla tilavuuksilla kuin 5 μl ( small ) mahdollistivat kalliiden formulaatioiden säästämisen ja hyvän toistettavuuden.
Anturin herkkyys ja mahdollisuus käyttää muutaman mikrolitran tilavuuksia small sekä mahdollisuus automaattiseen näytteenvaihtolaitteeseen tekevät DSC:stä arvokkaan tekniikan biomolekyylien analysointiin. Lämmitys-/jäähdytysnopeudesta riippuen läpimeno voi olla jopa 3 näytettä tunnissa.