Giriş
Lizozim veya muramidaz, bakteri hücrelerinin dış duvarında koruyucu bir tabaka oluşturan, şeker ve amino asitlerden oluşan yapısal bir makromolekül olan peptidoglikanları hidrolize eden bir grup enzimin adıdır. Lizozim doğada yaygın olarak bulunur; hayvanlarda, bitkilerde, bakterilerde ve ayrıca bakteriyofaj virüslerinde bulunur. Bakteriyel enfeksiyona karşı hareket eden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin bir parçasıdır. Tükürük ve gözyaşı gibi vücut salgılarında, dokularda ve ayrıca organlarda bulunabilir. Antibakteriyel ve antifungal aktivitesi nedeniyle, lizozim klinik, yem ve gıda uygulamalarında bir potansiyele sahiptir [2]. Ayrıca, çeşitli araştırma alanlarında protein yapısı, stabilitesi ve fonksiyonunun araştırılması için bir model molekül olarak yaygın bir şekilde uygulanmaktadır [3].
Lizozim, bulunduğu farklı canlılarda benzer kimyasal yapıya sahip small globüler bir proteindir, bkz. şekil 1. Farklı lizozim türleri üç ana ailede sınıflandırılır: tavuk tipi, gooset tipi ve omurgasız tipi. İnsan ve tavuk lizozimleri tavuk tipi olarak sınıflandırılır ve amino asit dizilimleri neredeyse %60 oranında aynıdır; tavuk lizozimi 129 amino asit kalıntısından (14,3 kDa) oluşurken, insan lizozimi 130 amino asit kalıntısına (14,7 kDa) sahiptir. Tavuk yumurtası akı, lizozimin ana ticari kaynağıdır [2,3]. Tavuk yumurtası akı lizozimi (HEWL) large pH aralığında (6 - 9) aktiftir ve pH 5.0'da 72°C'lik bir Erime Sıcaklıkları ve EntalpileriGizli ısı olarak da bilinen bir maddenin füzyon entalpisi, bir maddeyi katı halden sıvı hale dönüştürmek için gerekli olan enerji girdisinin, tipik olarak ısının bir ölçüsüdür. Bir maddenin erime noktası, katı (kristal) halden sıvı (izotropik eriyik) hale geçtiği sıcaklıktır. erime/geçiş sıcaklığını (Tm) temsil eder [4].
DSC, proteinlerin ve protein formülasyonlarının termal stabilitesini incelemek için büyük ölçüde uygulanmaktadır. Bir proteinin katlanması, hidrofobik gruplarının sulu ortama maruz kalmasından kaynaklanan EndotermikBir örnek geçişi veya bir reaksiyon, dönüşüm için ısı gerekiyorsa endotermiktir.endotermik bir etkidir medium. Bu nedenle, çözeltilerdeki proteinler için, DSC eğrisinde genellikle bir ısı absorpsiyon piki gözlenir ve bu pikin maksimum değeri literatürde Erime Sıcaklıkları ve EntalpileriGizli ısı olarak da bilinen bir maddenin füzyon entalpisi, bir maddeyi katı halden sıvı hale dönüştürmek için gerekli olan enerji girdisinin, tipik olarak ısının bir ölçüsüdür. Bir maddenin erime noktası, katı (kristal) halden sıvı (izotropik eriyik) hale geçtiği sıcaklıktır. erime/geçiş sıcaklığı (Tm) olarak adlandırılır. Termal denatürasyon (proteinin 3 boyutlu yapısının açılması), protein özelliklerine ve medium koşullarına bağlı olarak tersinir veya tersinmez olabilir, Şekil 2 [5]. Medium denatürasyonun tersinirliğini etkileyen koşullar arasında örneğin protein konsantrasyonu, pH, Ionic gücü ve sıcaklık yer alır. Bu nedenle protein yapısındaki veya formülasyondaki değişikliklerin medium proteinlerin termostabilitesini etkileyebileceği ve bunun da ölçülen Tm değerine yansıyacağı beklenmektedir.
DSC, katlanma süreciyle ilişkili ısı emilimini doğrudan ölçer. Yapısal modifikasyonlara uğrayan proteinleri karakterize etmek veya terapötik kullanım için protein formülasyonlarının termal stabilitesine erişmek için doğal bir proteinin termodinamik özelliklerini belirlemek için güvenilir bir yöntemdir.
Deneysel
Örnek Hazırlama Yöntemi
Lizozim1 damıtılmış ve filtrelenmiş2 suda 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml ve 5 mg/ml konsantrasyonlarda çözündürülmüştür. her konsantrasyondan 20 μl, hemen kapatılan Concavus® krozelerine3 pipetlendi. 24 mg/ml'lik çözelti için 5 μl'lik bir hacim de analiz edilmiştir. Her numune üzerinde en az üç ölçüm gerçekleştirilmiştir. Referans kroze aynı hacimde damıtılmış filtrelenmiş su ile doldurulmuştur. Ölçümler inert bir atmosfer altında (dinamik N2, 40 ml/dak) 10 K/dak ısıtma hızında gerçekleştirilmiştir.
1 Tavuk yumurtası akı lizozimi, ≥ 45 000 FIP U/mg, liyofilize, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polieter sülfon - PES membran filtre, 450 μm
3 Concavus® 40 μl alüminyum krozeler, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Ölçüm Sonuçları ve Tartışma
Lizozim sulu çözeltilerinin DSC eğrileri, ölçülen tüm konsantrasyonlar için 75°C aralığında tipik tek EndotermikBir örnek geçişi veya bir reaksiyon, dönüşüm için ısı gerekiyorsa endotermiktir.endotermik etki göstermektedir. Şekil 3'te 300, 200 ve 20 mg/ml konsantrasyonlarındaki çözeltilerin tipik eğrileri gösterilmektedir. Tahmin edilen başlangıç sıcaklığı, pik sıcaklığı (Tm) ve eğri altındaki alan (entalpi) konsantrasyona göre değişmektedir. Krozedeki numune kütlesi ne kadar yüksek olursa EndotermikBir örnek geçişi veya bir reaksiyon, dönüşüm için ısı gerekiyorsa endotermiktir.endotermik etki de o kadar genişler. Genişleme etkisi, ekstrapole edilen başlangıç ve pik sıcaklıklarının yanı sıra entalpinin değişimi sırasında gözlenir. Seçilen konsantrasyonlar, genellikle yüksek konsantrasyonda olan sıradan terapötik protein ilaçlarını temsil etmektedir ve protein dozajı mg/kg vücut ağırlığı olarak verilmiştir. Şekil 4, 20 mg/ml (5 μl) ve 5 mg/ml (20 μl) çözeltilerin DSC eğrilerini göstererek numune hacminin etkisini göstermektedir.
İlgili kütleler 0.13 mg ve 0.10 mg idi. Tüm ölçümlerin sonuçları tablo 1'de özetlenmiştir.
Tablo 1: Lizozimin DSC ile karakterizasyonu: konsantrasyon, protein kütlesi, ölçülen örneklerin hacimleri ve ilgili geçiş sıcaklıkları (pikler) ve entalpiler (alanlar)
Konsantrasyon (mg/ml) | Örnek Hacmi (μl) | Konsantrasyon (mM) | Protein Kütlesi (mg) | Alan (J/g) | Zirve (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Özet
Bu çalışmada DSC 300 Caliris®, ticari olarak mevcut protein formülasyonlarını temsil eden 5 ila 300 mg/ml gibi geniş bir konsantrasyon aralığında lizozimin geçiş sıcaklığını araştırmak için kullanılmıştır. Yüksek konsantrasyonlu çözeltiler kullanılmasına rağmen small 5 μl gibi hacimlerde ölçüm yapılması, pahalı formülasyonların yüksek tekrarlanabilirlikle korunmasına olanak sağlamıştır.
Sensör hassasiyeti ve birkaç mikrolitre aralığındaki small hacimlerin kullanılabilmesi ve otomatik numune değiştiriciye sahip olma imkanı, DSC'yi biyomoleküllerin analizi için değerli bir teknik haline getirmektedir. Isıtma/soğutma hızına bağlı olarak, verim saatte 3 numune kadar yüksek olabilir.