Въведение
Лизозим или мурамидаза е наименованието на група ензими, които хидролизират пептидогликаните - структурна макромолекула, съставена от захари и аминокиселини, образуваща защитния слой на външната стена на бактериалните клетки. Лизозимът е широко разпространен в природата, като присъства в животните, растенията, бактериите, а също и в бактериофаговите вируси. Той е част от вродената имунна система, действаща срещу бактериална инфекция. Може да се открие в телесни секрети като слюнка и сълзи, тъкани, а също и в органи. Благодарение на антибактериалната и противогъбичната си активност лизозимът има потенциал за клинични, фуражни и хранителни приложения [2]. Той също така се прилага широко като моделна молекула за изследване на протеиновата структура, стабилност и функция в редица изследователски области [3].
Лизозимът е small глобуларен протеин със сходна химична структура в различните живи същества, в които присъства, вж. фигура 1. Различните видове лизозими се класифицират в три основни семейства: тип пиле, тип гъска и тип безгръбначни. Човешкият и пилешкият лизозим са класифицирани като пилешки тип и са почти 60% идентични в аминокиселинната си последователност, докато пилешкият лизозим е съставен от 129 аминокиселинни остатъка (14,3 kDa), човешкият лизозим има 130 (14,7 kDa). Пилешкият яйчен белтък е основният търговски източник на лизозим [2,3]. Така нареченият лизозим от кокоши яйчен белтък (HEWL) е активен в large диапазон на рН (6 - 9) и представлява температура на топене/преход, Tm, от 72°C при рН 5,0 [4].
DSC се прилага в голяма степен за изследване на термичната стабилност на протеини и протеинови формули. Разгъването на белтъка е ендотермичен ефект, който е резултат от излагането на хидрофобните му групи на въздействието на водната среда medium. Поради това за протеини в разтвори често се наблюдава топлинен абсорбционен пик в DSC кривата, а неговият максимален пик се нарича в литературата температура на топене/преход (Tm). Топлинната денатурация (разгъване на триизмерната структура на протеина) може да бъде обратима или необратима в зависимост от характеристиките на протеина и от условията на medium, фигура 2 [5]. Medium условията, които влияят върху обратимостта на денатурацията, включват например концентрацията на протеина, рН, силата на Ionic и температурата. Поради това се очаква, че промените в структурата на протеина или във формулацията medium могат да повлияят на термостабилността на протеините, което се отразява в измерената Tm.
DSC измерва директно абсорбцията на топлина, свързана с процеса на разгъване. Той е надежден метод за определяне на термодинамичните характеристики на нативен протеин, за да се характеризират протеини, които са претърпели структурни модификации, или за достъп до термичната стабилност на протеинови формули за терапевтична употреба.
Експериментален
Метод за подготовка на пробата
Лизозимът1 е разтворен в дестилирана и филтрирана2 вода в концентрации от 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml и 5 mg/ml. 20 μl от всяка концентрация се пипетират в тигелиConcavus® 3 , които веднага се запечатват. За разтвора с концентрация 24 mg/ml беше анализиран и обем от 5 μl. Бяха извършени най-малко три измервания на всяка проба. Референтният тигел беше запълнен със същия обем дестилирана филтрирана вода. Измерванията бяха извършени в инертна атмосфера (динамичен N2, 40 ml/min) при скорост на нагряване 10 K/min.
1 Лизозим от кокоши яйчен белтък, ≥ 45 000 FIP U/mg, лиофилизиран, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Полиетер сулфон - PES мембранен филтър, 450 μm
3 Concavus® 40 μl алуминиеви тигели, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Резултати от измерванията и обсъждане
DSC кривите на водните разтвори на лизозим показват типичния единичен ендотермичен ефект в диапазона от 75°C за всички измерени концентрации. На фигура 3 са представени типични криви на разтвори с концентрации 300, 200 и 20 mg/ml. Екстраполираната начална температура, пиковата температура (Tm) и площта под кривата (енталпията) варират в зависимост от концентрацията. Колкото по-голяма е масата на пробата в тигела, толкова по-широк е ендотермичният ефект. Ефектът на разширяване се наблюдава по време на варирането на екстраполираните начална и пикова температури, както и на енталпията. Избраните концентрации са представителни за обикновените терапевтични белтъчни лекарства, които обикновено са силно концентрирани, като дозата на белтъка е дадена в mg/kg телесно тегло. Фигура 4 показва влиянието на обема на пробата, като показва DSC кривите на разтвори с концентрация 20 mg/ml (5 μl) и с концентрация 5 mg/ml (20 μl).
Съответните маси са 0,13 mg и 0,10 mg. Резултатите от всички измервания са обобщени в таблица 1.
Таблица 1: Характеризиране на лизозим чрез DSC: концентрация, маса на протеина, обеми на измерените проби и съответните температури на прехода (пикове) и енталпии (площи)
Концентрация (mg/ml) | Обем на пробата (μl) | Концентрация (mM) | Протеинова маса (mg) | Площ (J/g) | Връх (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Резюме
В това проучване DSC 300 Caliris® е използван за изследване на температурата на прехода на лизозим в широк диапазон от концентрации - от 5 до 300 mg/ml, който е представителен за наличните в търговската мрежа протеинови формули. Въпреки че са използвани разтвори с висока концентрация, измерването на обеми от 5 μl small позволява да се спестят скъпите препарати с висока възпроизводимост.
Чувствителността на сензора и възможността за използване на small обеми в диапазона от няколко микролитра, заедно с възможността за наличие на автоматичен пробовземач, превръщат DSC в ценна техника за анализ на биомолекули. В зависимост от скоростта на нагряване/охлаждане производителността може да достигне до 3 проби на час.