はじめに
リゾチーム、またはムラミダーゼは、細菌細胞の外壁の保護層を形成する糖とアミノ酸からなる構造高分子であるペプチドグリカンを加水分解する酵素群の名前である。リゾチームは自然界に広く存在し、動物、植物、細菌、そしてバクテリオファージ・ウイルスにも存在する。リゾチームは、細菌感染に対して働く自然免疫システムの一部である。唾液や涙などの体内分泌物、組織、臓器にも存在する。その抗菌・抗真菌活性から、リゾチームは臨床、飼料、食品への応用が期待されている[2]。また、タンパク質の構造、安定性、機能を調べるためのモデル分子として、いくつかの研究分野で広く応用されている [3]。
リゾチームはsmall 球状タンパク質であり、それが存在する様々な生物において類似した化学構造を持つ。異なるタイプのリゾチームは、ニワトリ型、グース型、無脊椎動物型の3つの主なファミリーに分類される。ヒトとニワトリのリゾチームはチキン型に分類され、そのアミノ酸配列はほぼ60％同一であるが、ニワトリのリゾチームは129アミノ酸残基（14.3kDa）から構成されているのに対し、ヒトのリゾチームは130アミノ酸残基（14.7kDa）である。鶏の卵白はリゾチームの主な商業的供給源である[2,3]。いわゆる鶏卵白色リゾチーム（HEWL）は、large pHの範囲（6 - 9）で活性を示し、pH 5.0での融解/転移温度Tmは72℃である[4]。
DSCは、タンパク質やタンパク質製剤の熱安定性を研究するために主に応用されている。タンパク質のフォールディング解除は、疎水基が水中に露出することに起因する吸熱（吸熱性）効果であるmedium 。そのため、溶液中のタンパク質では、DSC曲線に熱吸収ピークが観察されることが多く、そのピークの最大値は、文献では融解/転移温度(Tm)と呼ばれている。熱変性（タンパク質の3次元構造の展開）は、タンパク質の特性やmedium の条件によって、可逆的にも不可逆的にもなり得る。Medium 変性の可逆性に影響を与える条件としては、例えば、タンパク質濃度、pH、Ionic 強度、温度などがある。したがって、タンパク質の構造や製剤medium の変化がタンパク質の耐熱性に影響を与え、それが測定されたTmに反映されることが予想される。
DSCは、展開過程に伴う熱吸収を直接測定する。DSCは、構造改変を受けたタンパク質の特性を明らかにするため、あるいは治療用タンパク質製剤の熱安定性を調べるために、ネイティブタンパク質の熱力学的特性を決定するための信頼性の高い方法である。
実験的
試料調製法
リゾチーム1は、300 mg/ml、200 mg/ml、24 mg/ml、5 mg/mlの濃度で蒸留濾過水2に可溶化した。各濃度20μlをConcavus® るつぼ3にピペットで注入し、直ちに密封した。24 mg/mlの溶液については、5 μlの量も分析した。各試料について少なくとも3回の測定を行った。参照用容器は、同容量の蒸留濾過水で満たした。測定は不活性雰囲気下（ダイナミックN2、40ml/min）、加熱速度10K/minで行った。
1Hen egg white lysozyme, ≥ 45 000 FIP U/mg, lyophilized, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyether sulfone - PES membrane filter, 450 μm
3Concavus 40 μl aluminum crucibles,NETZSCH-Gerätebau GmbH
測定結果と考察
リゾチーム水溶液のDSC曲線は、すべての測定濃度において75℃の範囲で一般的な単一吸熱（吸熱性）を示した。図 3 は濃度 300、200、20 mg/ml の溶液の一般的な曲線である。外挿したオンセット温度、ピーク温度（Tm）、曲線下面積（エンタルピー）は濃度によって異なる。容器内の試料質量が大きいほど、吸熱（吸熱性）効果は広くなる。エンタルピーだけでなく、外挿されたオンセット温度とピーク温度の変動中にも、広がりの効果が観察される。選択した濃度は、通常、高濃度である通常の治療用タンパク質医薬品を代表するものであり、タンパク質の投与量は体重のmg/kgで示されている。図4は、20mg/ml（5μl）と5mg/ml（20μl）の溶液のDSC曲線を表示することで、試料量の影響を示している。
それぞれの質量は0.13 mgと0.10 mgであった。すべての測定結果を表1にまとめた。
表1：DSCによるリゾチームの特性評価：濃度、タンパク質質量、測定試料の体積、それぞれの転移温度（ピーク）とエンタルピー（面積）
濃度 (mg/ml） | 試料量 (μl） | 濃度 (mM) | タンパク質質量 (mg） | 面積 (J/g) | ピーク (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
概要
本研究では、DSC 300Caliris を用いて、市販のタンパク質製剤を代表する5～300 mg/mlの幅広い濃度範囲におけるリゾチームの転移温度を調べた。高濃度溶液が使用されたが、small 5μlの容量での測定により、高価な製剤を高い再現性で節約することができた。
センサーの感度と、small 数マイクロリットルの範囲の体積を使用する可能性、さらに自動試料交換装置の可能性により、DSCは生体分子の分析にとって価値ある技術となっている。加熱／冷却速度にもよるが、スループットは1時間当たり3試料と高い。