Úvod
Lysozym nebo muramidáza je název skupiny enzymů, které hydrolyzují peptidoglykany, strukturní makromolekuly složené z cukrů a aminokyselin, tvořící ochrannou vrstvu na vnější stěně bakteriálních buněk. Lysozym je v přírodě široce rozšířen, vyskytuje se u živočichů, rostlin, bakterií a také u bakteriofágních virů. Je součástí vrozeného imunitního systému působícího proti bakteriální infekci. Nachází se v tělesných sekretech, jako jsou sliny a slzy, ve tkáních a také v orgánech. Díky své antibakteriální a antimykotické aktivitě má lysozym potenciál pro klinické, krmivářské a potravinářské využití [2]. Je také široce používán jako modelová molekula pro zkoumání struktury, stability a funkce proteinů v několika oblastech výzkumu [3].
Lysozym je small globulární protein s podobnou chemickou strukturou v různých živých bytostech, ve kterých je přítomen, viz obr. 1. Různé typy lysozymů se dělí do tří hlavních rodin: kuřecí typ, husí typ a bezobratlí. Lidské a kuřecí lysozymy jsou klasifikovány jako kuřecí typ a jsou téměř ze 60 % shodné v aminokyselinové sekvenci, zatímco kuřecí lysozym se skládá ze 129 aminokyselinových zbytků (14,3 kDa), lidský lysozym jich má 130 (14,7 kDa). Kuřecí vaječný bílek je hlavním komerčním zdrojem lysozymu [2,3]. Tzv. lysozym ze slepičího vaječného bílku (HEWL) je aktivní v large rozsahu pH (6-9) a představuje teplotu tání/přechodu, Tm, 72 °C při pH 5,0 [4].
DSC se ve velké míře používá ke studiu tepelné stability proteinů a proteinových přípravků. Rozbalování proteinu je endotermický jev, který je výsledkem expozice jeho hydrofobních skupin vůči vodě medium. Proto je u proteinů v roztocích na DSC křivce často pozorován tepelný absorpční pík, jehož maximum se v literatuře označuje jako teplota tání/přechodu (Tm). Tepelná denaturace (rozkládání trojrozměrné struktury proteinu) může být reverzibilní nebo ireverzibilní, a to v závislosti na vlastnostech proteinu a na podmínkách medium, obr. 2 [5]. Mezi Medium podmínky, které ovlivňují reverzibilitu denaturace, patří např. koncentrace proteinu, pH, síla Ionic a teplota. Očekává se proto, že změny ve struktuře proteinu nebo ve formulaci medium mohou ovlivnit termostabilitu proteinů, což se projeví v naměřené hodnotě Tm.
DSC měří přímo absorpci tepla spojenou s procesem rozkládání. Je to spolehlivá metoda pro stanovení termodynamických charakteristik nativního proteinu, která umožňuje charakterizovat proteiny, které prošly strukturními modifikacemi, nebo zpřístupnit tepelnou stabilitu proteinových formulací pro terapeutické použití.
Experimentální
Metoda přípravy vzorku
Lysozym1 byl rozpouštěn v destilované a filtrované2 vodě v koncentracích 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml a 5 mg/ml. do kelímkůConcavus® 3 , které byly ihned uzavřeny, bylo pipetováno 20 μl každé koncentrace. U roztoku o koncentraci 24 mg/ml byl analyzován také objem 5 μl. U každého vzorku byla provedena nejméně tři měření. Referenční kelímek byl naplněn stejným objemem destilované filtrované vody. Měření se prováděla v inertní atmosféře (dynamický N2, 40 ml/min) při rychlosti ohřevu 10 K/min.
1 Lysozym ze slepičího vaječného bílku, ≥ 45 000 FIP U/mg, lyofilizovaný, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyether sulfone - PES membránový filtr, 450 μm
3 Concavus® 40 μl hliníkové kelímky, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Výsledky měření a diskuse
DSC křivky vodných roztoků lysozymu vykazují typický jednoduchý endotermický efekt v rozsahu 75 °C pro všechny měřené koncentrace. Na obrázku 3 jsou znázorněny typické křivky roztoků o koncentracích 300, 200 a 20 mg/ml. Extrapolovaná teplota nástupu, teplota vrcholu (Tm) a plocha pod křivkou (entalpie) se mění v závislosti na koncentraci. Čím vyšší je hmotnost vzorku v kelímku, tím širší je endotermický efekt. Rozšiřující účinek je pozorován při změnách extrapolovaných teplot nástupu a vrcholové teploty i entalpie. Zvolené koncentrace jsou reprezentativní pro běžné terapeutické bílkovinné léky, které jsou obvykle vysoce koncentrované, přičemž dávka bílkoviny je uvedena v mg/kg tělesné hmotnosti. Obrázek 4 ukazuje vliv objemu vzorku zobrazením DSC křivek roztoků o koncentraci 20 mg/ml (5 μl) a 5 mg/ml (20 μl).
Příslušné hmotnosti byly 0,13 mg a 0,10 mg. Výsledky všech měření jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1: Charakterizace lysozymu pomocí DSC: koncentrace, hmotnost proteinu, objemy měřených vzorků a příslušné přechodové teploty (píky) a entalpie (plochy)
Koncentrace (mg/ml) | Objem vzorku (μl) | Koncentrace (mM) | Hmotnost bílkovin (mg) | Plocha (J/g) | Vrchol (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Souhrn
V této studii byl přístroj DSC 300 Caliris® použit ke zkoumání teploty přechodu lysozymu v širokém rozmezí koncentrací od 5 do 300 mg/ml, což je reprezentativní hodnota pro komerčně dostupné proteinové preparáty. Přestože byly použity roztoky o vysokých koncentracích, měření na objemech small jako 5 μl umožnilo ušetřit drahé přípravky s vysokou reprodukovatelností.
Citlivost senzoru a možnost použití small objemů v rozsahu několika mikrolitrů spolu s možností mít k dispozici automatický měnič vzorků činí z DSC cennou techniku pro analýzu biomolekul. V závislosti na rychlosti ohřevu/chlazení může být výkonnost až 3 vzorky za hodinu.