Εισαγωγή
Η λυσοζύμη ή μουραμιδάση είναι το όνομα μιας ομάδας ενζύμων που υδρολύει τις πεπτιδογλυκάνες, ένα δομικό μακρομόριο που αποτελείται από σάκχαρα και αμινοξέα και σχηματίζει ένα προστατευτικό στρώμα στο εξωτερικό τοίχωμα των βακτηριακών κυττάρων. Η λυσοζύμη είναι ευρέως διαδεδομένη στη φύση, καθώς υπάρχει σε ζώα, φυτά, βακτήρια, αλλά και σε βακτηριοφάγους ιούς. Αποτελεί μέρος του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος που δρα κατά της βακτηριακής λοίμωξης. Μπορεί να βρεθεί σε σωματικές εκκρίσεις όπως το σάλιο και τα δάκρυα, σε ιστούς, αλλά και σε όργανα. Λόγω της αντιβακτηριακής και αντιμυκητιασικής δράσης της, η λυσοζύμη έχει δυνατότητες σε κλινικές εφαρμογές, ζωοτροφές και τρόφιμα [2]. Εφαρμόζεται επίσης ευρέως ως πρότυπο μόριο για τη διερεύνηση της δομής, της σταθερότητας και της λειτουργίας των πρωτεϊνών σε διάφορους ερευνητικούς τομείς [3].
Η λυσοζύμη είναι μια σφαιρική πρωτεΐνη small με παρόμοια χημική δομή στα διάφορα έμβια όντα στα οποία υπάρχει, βλέπε εικόνα 1. Οι διάφοροι τύποι λυσοζύμων ταξινομούνται σε τρεις κύριες οικογένειες: τύπου κοτόπουλου, τύπου χήνας και τύπου ασπόνδυλων. Τα λυσοζύμια του ανθρώπου και του κοτόπουλου κατατάσσονται στα λυσοζύμια τύπου κοτόπουλου και ταυτίζονται σχεδόν κατά 60% ως προς την αλληλουχία των αμινοξέων τους, ενώ η λυσοζύμη του κοτόπουλου αποτελείται από 129 κατάλοιπα αμινοξέων (14,3 kDa), η ανθρώπινη λυσοζύμη έχει 130 (14,7 kDa). Το ασπράδι αυγού κοτόπουλου είναι η κύρια εμπορική πηγή λυσοζύμης [2,3]. Η λεγόμενη λυσοζύμη από ασπράδι αυγού κότας (HEWL) είναι δραστική σε ένα εύρος pH (6 - 9) large και αντιπροσωπεύει θερμοκρασία τήξης/μετάβασης, Tm, 72°C σε pH 5,0 [4].
Η DSC εφαρμόζεται σε μεγάλο βαθμό για τη μελέτη της θερμικής σταθερότητας των πρωτεϊνών και των πρωτεϊνικών σκευασμάτων. Το ξεδίπλωμα μιας πρωτεΐνης είναι ένα ενδόθερμο αποτέλεσμα που προκύπτει από την έκθεση των υδρόφοβων ομάδων της στο υδατικό medium. Ως εκ τούτου, για τις πρωτεΐνες σε διαλύματα, παρατηρείται συχνά μια κορυφή απορρόφησης θερμότητας στην καμπύλη DSC και το μέγιστο της κορυφής της αναφέρεται στη βιβλιογραφία ως θερμοκρασία τήξης/μετάβασης (Tm). Η θερμική μετουσίωση (ξεδίπλωμα της τρισδιάστατης δομής της πρωτεΐνης) μπορεί να είναι αναστρέψιμη ή μη αναστρέψιμη, ανάλογα με τα χαρακτηριστικά της πρωτεΐνης και τις συνθήκες του medium, σχήμα 2 [5]. Medium συνθήκες που επηρεάζουν την αναστρεψιμότητα της μετουσίωσης περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης, το pH, την ισχύ του Ionic και τη θερμοκρασία. Επομένως, αναμένεται ότι αλλαγές στη δομή της πρωτεΐνης ή στη σύνθεση medium μπορούν να επηρεάσουν τη θερμοσταθερότητα των πρωτεϊνών, η οποία αντανακλάται στη μετρούμενη Tm.
Η DSC μετρά άμεσα την απορρόφηση θερμότητας που σχετίζεται με τη διαδικασία ξεδιπλώματος. Είναι μια αξιόπιστη μέθοδος για τον προσδιορισμό των θερμοδυναμικών χαρακτηριστικών μιας εγγενούς πρωτεΐνης για τον χαρακτηρισμό πρωτεϊνών που υπέστησαν δομικές τροποποιήσεις ή για την πρόσβαση στη θερμική σταθερότητα πρωτεϊνικών σκευασμάτων για θεραπευτική χρήση.
Πειραματικό
Μέθοδος προετοιμασίας δείγματος
Η λυσοζύμη1 διαλύθηκε σε απεσταγμένο και φιλτραρισμένο2 νερό σε συγκεντρώσεις 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml και 5 mg/ml. 20 μl από κάθε συγκέντρωση διοχετεύθηκαν με σιφώνιο σε χωνευτήρια Concavus® 3 τα οποία σφραγίστηκαν αμέσως. Για το διάλυμα στα 24 mg/ml, αναλύθηκε επίσης όγκος 5 μl. Πραγματοποιήθηκαν τουλάχιστον τρεις μετρήσεις σε κάθε δείγμα. Το χωνευτήρι αναφοράς γεμίστηκε με τον ίδιο όγκο αποσταγμένου φιλτραρισμένου νερού. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν υπό αδρανή ατμόσφαιρα (δυναμικό N2, 40 ml/min) με ρυθμό θέρμανσης 10 K/min.
1 Λυσοζύμη από ασπράδι αυγού κότας, ≥ 45 000 FIP U/mg, λυοφιλοποιημένη, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Φίλτρο μεμβράνης πολυαιθερμοσουλφόνης - PES, 450 μm
3 Concavus® Χωνευτήρια αλουμινίου 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Αποτελέσματα μετρήσεων και συζήτηση
Οι καμπύλες DSC των υδατικών διαλυμάτων λυσοζύμης παρουσιάζουν το τυπικό ενιαίο ενδόθερμο φαινόμενο στην περιοχή των 75°C για όλες τις μετρούμενες συγκεντρώσεις. Στο Σχήμα 3 απεικονίζονται τυπικές καμπύλες διαλυμάτων σε συγκεντρώσεις 300, 200 και 20 mg/ml. Η προεκτιμώμενη θερμοκρασία έναρξης, η θερμοκρασία κορυφής (Tm) και το εμβαδόν κάτω από την καμπύλη (ενθαλπία) μεταβάλλονται ανάλογα με τη συγκέντρωση. Όσο μεγαλύτερη είναι η μάζα του δείγματος στο χωνευτήρι, τόσο ευρύτερο είναι το ενδόθερμο φαινόμενο. Το φαινόμενο της διεύρυνσης παρατηρείται κατά τη μεταβολή των εξωπολωμένων θερμοκρασιών έναρξης και κορυφής καθώς και της ενθαλπίας. Οι επιλεγμένες συγκεντρώσεις είναι αντιπροσωπευτικές των συνήθων θεραπευτικών πρωτεϊνικών φαρμάκων, τα οποία είναι συνήθως ιδιαίτερα συμπυκνωμένα, με τη δοσολογία της πρωτεΐνης να δίνεται σε mg/kg σωματικού βάρους. Στο Σχήμα 4 παρουσιάζεται η επίδραση του όγκου του δείγματος με την απεικόνιση των καμπυλών DSC διαλυμάτων στα 20 mg/ml (5 μl) και στα 5 mg/ml (20 μl).
Οι αντίστοιχες μάζες ήταν 0,13 mg και 0,10 mg. Τα αποτελέσματα όλων των μετρήσεων συνοψίζονται στον πίνακα 1.
Πίνακας 1: Χαρακτηρισμός της λυσοζύμης μέσω DSC: συγκέντρωση, μάζα πρωτεΐνης, όγκοι μετρούμενων δειγμάτων και οι αντίστοιχες θερμοκρασίες μετάβασης (κορυφές) και ενθαλπίες (περιοχές)
Συγκέντρωση (mg/ml) | Όγκος δείγματος (μl) | Συγκέντρωση (mM) | Μάζα πρωτεΐνης (mg) | Περιοχή (J/g) | Κορυφή (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Περίληψη
Στην παρούσα μελέτη, η DSC 300 Caliris® χρησιμοποιήθηκε για τη διερεύνηση της θερμοκρασίας μετάβασης της λυσοζύμης σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων, από 5 έως 300 mg/ml, το οποίο είναι αντιπροσωπευτικό των εμπορικά διαθέσιμων πρωτεϊνικών σκευασμάτων. Παρόλο που χρησιμοποιήθηκαν διαλύματα υψηλής συγκέντρωσης, η μέτρηση σε όγκους τόσο small όσο 5 μl επέτρεψε την εξοικονόμηση των ακριβών σκευασμάτων με υψηλή αναπαραγωγιμότητα.
Η ευαισθησία του αισθητήρα και η δυνατότητα χρήσης όγκων small της τάξης των μερικών μικρολίτρων, σε συνδυασμό με τη δυνατότητα αυτοματοποιημένης αλλαγής δείγματος, καθιστούν την DSC μια πολύτιμη τεχνική για την ανάλυση βιομορίων. Ανάλογα με τον ρυθμό θέρμανσης/ψύξης, η απόδοση μπορεί να φτάσει τα 3 δείγματα ανά ώρα.