Introduction
Le lysozyme, ou muramidase, est le nom d'un groupe d'enzymes qui hydrolysent les peptidoglycanes, une macromolécule structurelle composée de sucres et d'acides aminés, formant une couche protectrice sur la paroi externe des cellules bactériennes. Le lysozyme est très répandu dans la nature, puisqu'il est présent chez les animaux, les plantes, les bactéries et les virus bactériophages. Il fait partie du système immunitaire inné qui agit contre les infections bactériennes. On le trouve dans les sécrétions corporelles telles que la salive et les larmes, dans les tissus et dans les organes. En raison de son activité antibactérienne et antifongique, le lysozyme a un potentiel dans les applications cliniques, alimentaires et d'alimentation animale [2]. Il est également largement utilisé comme molécule modèle pour l'étude de la structure, de la stabilité et de la fonction des protéines dans plusieurs domaines de recherche [3].
Le lysozyme est une protéine globulaire small dont la structure chimique est similaire dans les différents êtres vivants où elle est présente (voir figure 1). Les différents types de lysozymes sont classés en trois grandes familles : les lysozymes de type poulet, les lysozymes de type gosier et les lysozymes de type invertébré. Le lysozyme humain et le lysozyme de poulet sont classés dans la famille des lysozymes de type poulet et leur séquence d'acides aminés est identique à près de 60 %. Le lysozyme de poulet est composé de 129 acides aminés (14,3 kDa), tandis que le lysozyme humain en compte 130 (14,7 kDa). Le blanc d'œuf de poule est la principale source commerciale de lysozyme [2,3]. Le lysozyme de blanc d'œuf de poule (HEWL) est actif dans une gamme de pH large (6 - 9) et présente une Températures et enthalpies de fusionL'enthalpie de fusion d'une substance, également connue sous le nom de chaleur latente, est une mesure de l'apport d'énergie, généralement de la chaleur, nécessaire pour convertir une substance de l'état solide à l'état liquide. Le point de fusion d'une substance est la température à laquelle elle passe de l'état solide (cristallin) à l'état liquide (fusion isotrope). température de fusion/transition, Tm, de 72°C à un pH de 5,0 [4].
La DSC est largement utilisée pour étudier la Stabilité thermiqueUn matériau est thermiquement stable s'il ne se décompose pas sous l'influence de la température. Une façon de déterminer la stabilité thermique d'une substance est d'utiliser un ATG (analyseur thermogravimétrique). stabilité thermique des protéines et des formulations de protéines. Le dépliage d'une protéine est un effet EndothermiqueUne transition d'échantillon ou une réaction est endothermique si la conversion nécessite de la chaleur.endothermique résultant de l'exposition de ses groupes hydrophobes à la solution aqueuse medium. Par conséquent, pour les protéines en solution, un pic d'absorption de chaleur est souvent observé dans la courbe DSC, et son maximum est désigné dans la littérature comme la Températures et enthalpies de fusionL'enthalpie de fusion d'une substance, également connue sous le nom de chaleur latente, est une mesure de l'apport d'énergie, généralement de la chaleur, nécessaire pour convertir une substance de l'état solide à l'état liquide. Le point de fusion d'une substance est la température à laquelle elle passe de l'état solide (cristallin) à l'état liquide (fusion isotrope). température de fusion/transition (Tm). La dénaturation thermique (dépliage de la structure tridimensionnelle de la protéine) peut être réversible ou irréversible, en fonction des caractéristiques de la protéine et des conditions de medium, figure 2 [5]. Medium conditions qui influencent la réversibilité de la dénaturation comprennent, par exemple, la concentration de la protéine, le pH, Ionic force et la température. On s'attend donc à ce que des changements dans la structure de la protéine ou dans la formulation medium puissent influencer la thermostabilité des protéines, ce qui se reflète dans le Tm mesuré.
La DSC mesure directement l'absorption de chaleur associée au processus de dépliage. C'est une méthode fiable pour déterminer les caractéristiques thermodynamiques d'une protéine native afin de caractériser les protéines qui ont subi des modifications structurelles ou d'accéder à la Stabilité thermiqueUn matériau est thermiquement stable s'il ne se décompose pas sous l'influence de la température. Une façon de déterminer la stabilité thermique d'une substance est d'utiliser un ATG (analyseur thermogravimétrique). stabilité thermique des formulations de protéines à usage thérapeutique.
Expérimental
Méthode de préparation des échantillons
Le lysozyme1 a été solubilisé dans de l'eau distillée et filtrée2 à des concentrations de 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml et 5 mg/ml. 20 μl de chaque concentration ont été pipetés dans des creusetsConcavus® 3 qui ont été immédiatement scellés. Pour la solution à 24 mg/ml, un volume de 5 μl a également été analysé. Au moins trois mesures ont été effectuées sur chaque échantillon. Le creuset de référence a été rempli avec le même volume d'eau distillée filtrée. Les mesures ont été effectuées sous atmosphère inerte (N2 dynamique, 40 ml/min) à une vitesse de chauffage de 10 K/min.
1 Lysozyme de blanc d'œuf de poule, ≥ 45 000 FIP U/mg, lyophilisé, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtre à membrane en polyéther sulfone - PES, 450 μm
3 Concavus® Creusets en aluminium de 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Résultats des mesures et discussion
Les courbes DSC des solutions aqueuses de lysozyme montrent l'effet EndothermiqueUne transition d'échantillon ou une réaction est endothermique si la conversion nécessite de la chaleur.endothermique unique typique dans la plage de 75°C pour toutes les concentrations mesurées. La figure 3 illustre les courbes typiques des solutions à des concentrations de 300, 200 et 20 mg/ml. La température d'apparition extrapolée, la température de pointe (Tm) et l'aire sous la courbe (enthalpie) varient en fonction de la concentration. Plus la masse de l'échantillon dans le creuset est élevée, plus l'effet EndothermiqueUne transition d'échantillon ou une réaction est endothermique si la conversion nécessite de la chaleur.endothermique est important. L'effet d'élargissement est observé lors de la variation des températures extrapolées d'apparition et de pic ainsi que de l'enthalpie. Les concentrations choisies sont représentatives des protéines thérapeutiques ordinaires, qui sont généralement très concentrées, le dosage des protéines étant donné en mg/kg de poids corporel. La figure 4 montre l'influence du volume de l'échantillon en affichant les courbes DSC de solutions à 20 mg/ml (5 μl) et à 5 mg/ml (20 μl).
Les masses respectives étaient de 0,13 mg et 0,10 mg. Les résultats de toutes les mesures sont résumés dans le tableau 1.
Tableau 1 : Caractérisation du lysozyme au moyen de la DSC : concentration, masse de la protéine, volumes des échantillons mesurés et températures de transition (pics) et enthalpies (aires) respectives
Concentration (mg/ml) | Volume de l'échantillon (μl) | Concentration (mM) | Masse de protéines (mg) | Surface (J/g) | Pic (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Résumé
Dans cette étude, le DSC 300 Caliris® a été utilisé pour étudier la température de transition du lysozyme dans une large gamme de concentrations, de 5 à 300 mg/ml, ce qui est représentatif des formulations de protéines disponibles dans le commerce. Bien que des solutions à forte concentration aient été utilisées, la mesure sur des volumes aussi small que 5 μl a permis d'économiser les formulations coûteuses avec une grande reproductibilité.
La sensibilité du capteur et la possibilité d'utiliser des volumes small de l'ordre de quelques microlitres, ainsi que la possibilité de disposer d'un passeur d'échantillons automatisé, font de la DSC une technique précieuse pour l'analyse des biomolécules. En fonction de la vitesse de chauffage/refroidissement, le débit peut atteindre 3 échantillons par heure.