Введение
Лизоцим, или мурамидаза, - название группы ферментов, гидролизующих пептидогликаны, структурные макромолекулы, состоящие из сахаров и аминокислот, образующие защитный слой на внешней стенке бактериальных клеток. Лизоцим широко распространен в природе, он присутствует в организме животных, растений, бактерий, а также в вирусах-бактериофагах. Он является частью врожденной иммунной системы, действующей против бактериальной инфекции. Его можно обнаружить в секретах организма, таких как слюна и слезы, тканях, а также в органах. Благодаря своей антибактериальной и противогрибковой активности лизоцим может найти применение в клинической практике, кормах и продуктах питания [2]. Он также широко применяется в качестве модельной молекулы для исследования структуры, стабильности и функции белков в нескольких областях исследований [3].
Лизоцим - это глобулярный белок small, имеющий сходную химическую структуру у различных живых существ, в которых он присутствует, см. рисунок 1. Различные типы лизоцимов делятся на три основных семейства: куриный тип, гусиный тип и беспозвоночный тип. Лизоцимы человека и курицы относятся к куриному типу и почти на 60 % идентичны по аминокислотной последовательности, в то время как лизоцим курицы состоит из 129 аминокислотных остатков (14,3 кДа), лизоцим человека - из 130 (14,7 кДа). Белок куриного яйца является основным коммерческим источником лизоцима [2,3]. Так называемый лизоцим белка куриного яйца (HEWL) активен в диапазоне рН large (6 - 9) и имеет температуру плавления/перехода Tm 72°C при рН 5,0 [4].
ДСК в значительной степени применяется для изучения термической стабильности белков и белковых рецептур. Разворачивание белка - это эндотермический эффект, возникающий в результате воздействия его гидрофобных групп на водный раствор medium. Поэтому для белков в растворах на кривой ДСК часто наблюдается пик поглощения тепла, максимум которого в литературе называют температурой плавления/перехода (Tm). Термическая денатурация (разворачивание 3-мерной структуры белка) может быть обратимой или необратимой, в зависимости от характеристик белка и условий medium, рисунок 2 [5]. Medium условия, влияющие на обратимость денатурации, включают, например, концентрацию белка, pH, Ionic силу и температуру. Поэтому ожидается, что изменения в структуре белка или в рецептуре medium могут влиять на термостабильность белков, что отражается на измерении Tm.
ДСК напрямую измеряет поглощение тепла, связанное с процессом разворачивания. Это надежный метод определения термодинамических характеристик нативного белка для характеристики белков, подвергшихся структурным модификациям, или для доступа к термической стабильности белковых составов для терапевтического использования.
Экспериментальный
Метод подготовки образцов
Лизоцим1 был солюбилизирован в дистиллированной и фильтрованной2 воде в концентрациях 300 мг/мл, 200 мг/мл, 24 мг/мл и 5 мг/мл. по 20 мкл раствора каждой концентрации пипетировали в тигли Concavus® 3, которые сразу же герметично закрывали. Для раствора с концентрацией 24 мг/мл также анализировался объем 5 мкл. Для каждого образца проводилось не менее трех измерений. Контрольный тигель заполняли таким же объемом дистиллированной фильтрованной воды. Измерения проводились в инертной атмосфере (динамический N2, 40 мл/мин) при скорости нагрева 10 К/мин.
1 Лизоцим из белка куриного яйца, ≥ 45 000 FIP U/mg, лиофилизированный, 14 кДа, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Полиэфирсульфон - мембранный фильтр PES, 450 мкм
3 Concavus® 40 мкл алюминиевые тигли, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Результаты измерений и обсуждение
Кривые ДСК водных растворов лизоцима демонстрируют типичный единичный эндотермический эффект в диапазоне 75°C для всех измеренных концентраций. На рисунке 3 представлены типичные кривые растворов с концентрациями 300, 200 и 20 мг/мл. Экстраполированная температура начала, температура пика (Tm) и площадь под кривой (энтальпия) изменяются в зависимости от концентрации. Чем больше масса образца в тигле, тем шире эндотермический эффект. Эффект расширения наблюдается при изменении экстраполированных начальной и пиковой температур, а также энтальпии. Выбранные концентрации являются репрезентативными для обычных терапевтических белковых препаратов, которые обычно являются высококонцентрированными, а дозировка белка указана в мг/кг массы тела. Рисунок 4 демонстрирует влияние объема образца, показывая кривые ДСК растворов 20 мг/мл (5 мкл) и 5 мг/мл (20 мкл).
Соответствующие массы составили 0,13 мг и 0,10 мг. Результаты всех измерений сведены в таблицу 1.
Таблица 1: Характеристика лизоцима с помощью ДСК: концентрация, масса белка, объемы измеренных образцов и соответствующие температуры перехода (пики) и энтальпии (площади)
Концентрация (мг/мл) | Объем образца (мкл) | Концентрация (мМ) | Масса белка (мг) | Площадь (Дж/г) | Пик (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Резюме
В данном исследовании DSC 300 Caliris® был использован для изучения температуры перехода лизоцима в широком диапазоне концентраций, от 5 до 300 мг/мл, что соответствует коммерчески доступным белковым составам. Несмотря на то, что использовались высококонцентрированные растворы, измерения на объемах small от 5 мкл позволили сохранить дорогостоящие составы с высокой воспроизводимостью.
Чувствительность датчика и возможность использования объемов small в диапазоне нескольких микролитров, а также возможность автоматической смены образцов делают ДСК ценным методом для анализа биомолекул. В зависимости от скорости нагрева/охлаждения производительность может достигать 3 образцов в час.