Introduzione
Il lisozima, o muramidasi, è il nome di un gruppo di enzimi che idrolizza i peptidoglicani, una macromolecola strutturale composta da zuccheri e aminoacidi, che forma uno strato protettivo sulla parete esterna delle cellule batteriche. Il lisozima è molto diffuso in natura, essendo presente in animali, piante, batteri e anche nei virus batteriofagi. Fa parte del sistema immunitario innato che agisce contro le infezioni batteriche. Si trova nelle secrezioni corporee come la saliva e le lacrime, nei tessuti e anche negli organi. Grazie alla sua attività antibatterica e antimicotica, il lisozima ha un potenziale in applicazioni cliniche, mangimistiche e alimentari [2]. È anche ampiamente applicato come molecola modello per lo studio della struttura, della stabilità e della funzione delle proteine in diverse aree di ricerca [3].
Il lisozima è una proteina globulare small con una struttura chimica simile nei diversi esseri viventi in cui è presente (vedi figura 1). I diversi tipi di lisozimi sono classificati in tre famiglie principali: tipo pollo, tipo oca e tipo invertebrato. I lisozimi umani e di pollo sono classificati come tipo pollo e sono quasi il 60% identici nella loro sequenza aminoacidica, mentre il lisozima di pollo è composto da 129 residui aminoacidici (14,3 kDa), il lisozima umano ne ha 130 (14,7 kDa). L'albume d'uovo di gallina è la principale fonte commerciale di lisozima [2,3]. Il cosiddetto lisozima dell'albume d'uovo di gallina (HEWL) è attivo in un intervallo di pH large (6-9) e presenta una Temperature di fusione ed entalpieL'entalpia di fusione di una sostanza, nota anche come calore latente, è una misura dell'apporto di energia, tipicamente calore, necessario per convertire una sostanza dallo stato solido a quello liquido. Il punto di fusione di una sostanza è la temperatura alla quale essa cambia stato da solido (cristallino) a liquido (fusione isotropa). temperatura di fusione/transizione, Tm, di 72°C a pH 5,0 [4].
La DSC è ampiamente applicata per studiare la Stabilità termicaUn materiale è termicamente stabile se non si decompone sotto l'influenza della temperatura. Un modo per determinare la stabilità termica di una sostanza è quello di utilizzare un TGA (analizzatore termogravimetrico). stabilità termica delle proteine e delle formulazioni proteiche. Lo scioglimento di una proteina è un effetto EndotermicoUna transizione campionaria o una reazione è endotermica se per la conversione è necessario il calore.endotermico derivante dall'esposizione dei suoi gruppi idrofobici all'acqua medium. Pertanto, per le proteine in soluzione, nella curva DSC si osserva spesso un picco di assorbimento termico, il cui massimo è indicato in letteratura come Temperature di fusione ed entalpieL'entalpia di fusione di una sostanza, nota anche come calore latente, è una misura dell'apporto di energia, tipicamente calore, necessario per convertire una sostanza dallo stato solido a quello liquido. Il punto di fusione di una sostanza è la temperatura alla quale essa cambia stato da solido (cristallino) a liquido (fusione isotropa). temperatura di fusione/transizione (Tm). La denaturazione termica (dispiegamento della struttura tridimensionale della proteina) può essere reversibile o irreversibile, a seconda delle caratteristiche della proteina e delle condizioni di medium, figura 2 [5]. Medium condizioni che influenzano la reversibilità della denaturazione includono, ad esempio, la concentrazione della proteina, il pH, la forza Ionic e la temperatura. Ci si aspetta quindi che cambiamenti nella struttura della proteina o nella formulazione medium possano influenzare la termostabilità delle proteine, che si riflette nella Tm misurata.
La DSC misura direttamente l'assorbimento di calore associato al processo di unfolding. È un metodo affidabile per determinare le caratteristiche termodinamiche di una proteina nativa, per caratterizzare proteine che hanno subito modifiche strutturali o per accedere alla Stabilità termicaUn materiale è termicamente stabile se non si decompone sotto l'influenza della temperatura. Un modo per determinare la stabilità termica di una sostanza è quello di utilizzare un TGA (analizzatore termogravimetrico). stabilità termica di formulazioni proteiche per uso terapeutico.
Sperimentale
Metodo di preparazione dei campioni
Il lisozima1 è stato solubilizzato in acqua distillata e filtrata2 a concentrazioni di 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml e 5 mg/ml. 20 μl di ciascuna concentrazione sono stati pipettati in crogioliConcavus® 3 che sono stati immediatamente sigillati. Per la soluzione a 24 mg/ml è stato analizzato anche un volume di 5 μl. Sono state effettuate almeno tre misurazioni su ciascun campione. Il crogiolo di riferimento è stato riempito con lo stesso volume di acqua distillata filtrata. Le misure sono state eseguite in atmosfera inerte (N2 dinamico, 40 ml/min) a una velocità di riscaldamento di 10 K/min.
1 Lisozima di albume di gallina, ≥ 45 000 FIP U/mg, liofilizzato, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Filtro a membrana in polietere solfone - PES, 450 μm
3 Concavus® Crogioli di alluminio da 40 μl, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Risultati delle misure e discussione
Le curve DSC delle soluzioni acquose di lisozima mostrano il tipico effetto EndotermicoUna transizione campionaria o una reazione è endotermica se per la conversione è necessario il calore.endotermico singolo nell'intervallo di 75°C per tutte le concentrazioni misurate. La Figura 3 mostra le curve tipiche delle soluzioni a concentrazioni di 300, 200 e 20 mg/ml. La temperatura di insorgenza estrapolata, la temperatura di picco (Tm) e l'area sotto la curva (entalpia) variano con la concentrazione. Maggiore è la massa del campione nel crogiolo, più ampio è l'effetto EndotermicoUna transizione campionaria o una reazione è endotermica se per la conversione è necessario il calore.endotermico. L'effetto di ampliamento si osserva durante la variazione delle temperature di inizio e di picco estrapolate e dell'entalpia. Le concentrazioni scelte sono rappresentative dei comuni farmaci proteici terapeutici, che di solito sono altamente concentrati, con il dosaggio delle proteine indicato in mg/kg di peso corporeo. La Figura 4 mostra l'influenza del volume del campione visualizzando le curve DSC di soluzioni a 20 mg/ml (5 μl) e a 5 mg/ml (20 μl).
Le rispettive masse erano 0,13 mg e 0,10 mg. I risultati di tutte le misurazioni sono riassunti nella tabella 1.
Tabella 1: Caratterizzazione del lisozima mediante DSC: concentrazione, massa proteica, volumi dei campioni misurati e rispettive temperature di transizione (picchi) ed entalpie (aree)
Concentrazione (mg/ml) | Volume del campione (μl) | Concentrazione (mM) | Massa proteica (mg) | Area (J/g) | Picco (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Sintesi
In questo studio, il DSC 300 Caliris® è stato utilizzato per analizzare la temperatura di transizione del lisozima in un ampio intervallo di concentrazioni, da 5 a 300 mg/ml, rappresentativo delle formulazioni proteiche disponibili in commercio. Sebbene siano state utilizzate soluzioni ad alta concentrazione, la misurazione su volumi small di 5 μl ha permesso di risparmiare le costose formulazioni con un'elevata riproducibilità.
La sensibilità del sensore e la possibilità di utilizzare small volumi dell'ordine di pochi microlitri, insieme alla possibilità di disporre di un sistema di cambio campione automatizzato, rendono la DSC una tecnica preziosa per l'analisi delle biomolecole. A seconda della velocità di riscaldamento/raffreddamento, la produttività può raggiungere i 3 campioni all'ora.