Introduktion
Lysozym eller muramidase er navnet på en gruppe enzymer, der hydrolyserer peptidoglycaner, et strukturelt makromolekyle bestående af sukkerarter og aminosyrer, der danner et beskyttende lag på bakteriecellernes ydervæg. Lysozym er vidt udbredt i naturen og findes i dyr, planter, bakterier og også i bakteriofag-vira. Det er en del af det medfødte immunsystem, der virker mod bakterieinfektion. Det findes i kropssekreter som spyt og tårer, væv og også i organer. På grund af sin antibakterielle og svampedræbende aktivitet har lysozym et potentiale inden for kliniske anvendelser, foder og fødevarer [2]. Det anvendes også i vid udstrækning som et modelmolekyle til undersøgelse af proteinstruktur, stabilitet og funktion inden for flere forskningsområder [3].
Lysozym er et small kugleformet protein med en lignende kemisk struktur i de forskellige levende væsener, hvor det er til stede, se figur 1. De forskellige typer lysozymer klassificeres i tre hovedfamilier: kyllingetypen, gåsetypen og den hvirvelløse type. Lysozymer fra mennesker og kyllinger er klassificeret som kyllingetype og er næsten 60 % identiske i deres aminosyresekvens, mens kyllingelysozym består af 129 aminosyrerester (14,3 kDa), mens menneskelysozym har 130 (14,7 kDa). Hønseægshvide er den vigtigste kommercielle kilde til lysozym [2,3]. Det såkaldte hønseægshvide lysozym (HEWL) er aktivt i et large pH-område (6-9) og har en smelte-/overgangstemperatur, Tm, på 72 °C ved pH 5,0 [4].
DSC anvendes i vid udstrækning til at undersøge den termiske stabilitet af proteiner og proteinformuleringer. Udfoldning af et protein er en EndotermEn prøveovergang eller en reaktion er endoterm, hvis der er brug for varme til omdannelsen.endoterm effekt, der skyldes eksponering af dets hydrofobe grupper for det vandige medium. For proteiner i opløsning ses der derfor ofte en varmeabsorptionsspids i DSC-kurven, og spidsens maksimum omtales i litteraturen som smelte-/overgangstemperaturen (Tm). Den termiske denaturering (udfoldning af proteinets 3-dimensionelle struktur) kan være reversibel eller irreversibel, afhængigt af proteinets egenskaber og forholdene på medium, figur 2 [5]. Medium forhold, der påvirker denatureringens reversibilitet, omfatter f.eks. proteinkoncentration, pH, Ionic styrke og temperatur. Det forventes derfor, at ændringer i proteinstrukturen eller i formuleringen medium kan påvirke proteinernes termostabilitet, hvilket afspejles i den målte Tm.
DSC måler direkte den varmeabsorption, der er forbundet med udfoldningsprocessen. Det er en pålidelig metode til at bestemme de termodynamiske egenskaber ved et naturligt protein for at karakterisere proteiner, der har gennemgået strukturelle ændringer, eller for at få adgang til den termiske stabilitet af proteinformuleringer til terapeutisk brug.
Eksperimentel
Metode til prøveforberedelse
Lysozym1 blev opløst i destilleret og filtreret2 vand i koncentrationer på 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml og 5 mg/ml. 20 μl af hver koncentration blev pipetteret ind i Concavus® digler3, der straks blev forseglet. For opløsningen ved 24 mg/ml blev der også analyseret et volumen på 5 μl. Der blev foretaget mindst tre målinger på hver prøve. Referencesmeltediglen blev fyldt med samme volumen destilleret filtreret vand. Målingerne blev udført under en inaktiv atmosfære (dynamisk N2, 40 ml/min) ved en opvarmningshastighed på 10 K/min.
1 Hønselysozym, ≥ 45 000 FIP U/mg, frysetørret, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyethersulfon - PES-membranfilter, 450 μm
3 Concavus® 40 μl aluminiumdigler, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Måleresultater og diskussion
DSC-kurverne for vandige lysozymopløsninger viser den typiske enkeltstående endoterme effekt i området 75 °C for alle målte koncentrationer. Figur 3 viser typiske kurver for opløsninger med koncentrationer på 300, 200 og 20 mg/ml. Den ekstrapolerede begyndelsestemperatur, spidstemperaturen (Tm) og arealet under kurven (entalpi) varierer med koncentrationen. Jo højere masse prøven har i diglen, jo bredere er den endoterme effekt. Den bredere effekt observeres under variation af de ekstrapolerede start- og spidstemperaturer samt entalpien. De valgte koncentrationer er repræsentative for almindelige terapeutiske proteinlægemidler, som normalt er meget koncentrerede, med proteindoseringen angivet i mg/kg kropsvægt. Figur 4 viser indflydelsen af prøvevolumenet ved at vise DSC-kurverne for opløsninger på 20 mg/ml (5 μl) og på 5 mg/ml (20 μl).
De respektive masser var 0,13 mg og 0,10 mg. Resultaterne af alle målinger er opsummeret i tabel 1.
Tabel 1: Karakterisering af lysozym ved hjælp af DSC: koncentration, proteinmasse, mængder af målte prøver og de respektive overgangstemperaturer (toppe) og entalpier (områder)
Koncentration (mg/ml) | Prøvevolumen (μl) | Koncentration (mM) | Proteinmasse (mg) | Areal (J/g) | Peak (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Sammenfatning
I denne undersøgelse blev DSC 300 Caliris® brugt til at undersøge overgangstemperaturen for lysozym i en bred vifte af koncentrationer, fra 5 til 300 mg/ml, hvilket er repræsentativt for kommercielt tilgængelige proteinformuleringer. Selvom der blev brugt højkoncentrerede opløsninger, gjorde måling på volumener så small som 5 μl det muligt at spare de dyre formuleringer med høj reproducerbarhed.
Sensorfølsomheden og muligheden for at bruge small volumener i størrelsesordenen nogle få mikroliter sammen med muligheden for at have en automatiseret prøveskifter gør DSC til en værdifuld teknik til analyse af biomolekyler. Afhængigt af opvarmnings-/afkølingshastigheden kan gennemstrømningen være så høj som 3 prøver i timen.