Inledning
Lysozym, eller muramidas, är namnet på en grupp enzymer som hydrolyserar peptidoglykaner, en strukturell makromolekyl som består av sockerarter och aminosyror och som bildar ett skyddande lager på bakteriecellernas yttre vägg. Lysozym är utbrett i naturen och finns i djur, växter, bakterier och även i bakteriofagvirus. Det är en del av det medfödda immunförsvaret som verkar mot bakterieinfektioner. Det finns i kroppssekret som saliv och tårar, i vävnader och även i organ. På grund av sin antibakteriella och svampdödande aktivitet har lysozym en potential inom kliniska tillämpningar, foder och livsmedel [2]. Det används också ofta som en modellmolekyl för att undersöka proteinstruktur, stabilitet och funktion inom flera forskningsområden [3].
Lysozym är ett small globulärt protein med en liknande kemisk struktur i de olika levande varelser där det förekommer, se figur 1. De olika typerna av lysozymer klassificeras i tre huvudfamiljer: kycklingtyp, gåstyp och ryggradslösa djur. Människans och kycklingens lysozymer klassificeras som kycklingtyp och är nästan 60% identiska i sin aminosyrasekvens, medan kycklinglysozym består av 129 aminosyrarester (14,3 kDa), har människans lysozym 130 (14,7 kDa). Kycklingäggvita är den viktigaste kommersiella källan till lysozym [2,3]. Det så kallade hönsäggvite-lysozymet (HEWL) är aktivt i ett large pH-intervall (6-9) och har en smält-/övergångstemperatur, Tm, på 72°C vid pH 5,0 [4].
DSC används i stor utsträckning för att studera den termiska stabiliteten hos proteiner och proteinformuleringar. Att veckla ut ett protein är en endotermisk effekt som beror på att dess hydrofoba grupper exponeras för vatten medium. För proteiner i lösningar observeras därför ofta en värmeabsorptionstopp i DSC-kurvan, och toppens maximum kallas i litteraturen för smält-/övergångstemperaturen (Tm). Den termiska denatureringen (uppveckning av proteinets 3-dimensionella struktur) kan vara reversibel eller irreversibel, beroende på proteinets egenskaper och på förhållandena på medium, figur 2 [5]. Medium förhållanden som påverkar denatureringens reversibilitet är t.ex. proteinkoncentration, pH, Ionic styrka och temperatur. Det förväntas därför att förändringar i proteinstrukturen eller i formuleringen medium kan påverka proteinernas termostabilitet, vilket avspeglas i den uppmätta Tm.
DSC mäter direkt den värmeabsorption som är förknippad med uppveckningsprocessen. Det är en tillförlitlig metod för att bestämma de termodynamiska egenskaperna hos ett nativt protein för att karakterisera proteiner som genomgått strukturella modifieringar eller för att få tillgång till den termiska stabiliteten hos proteinformuleringar för terapeutisk användning.
Experimentell
Metod för beredning av prov
Lysozym1 solubiliserades i destillerat och filtrerat2 vatten i koncentrationerna 300 mg/ml, 200 mg/ml, 24 mg/ml och 5 mg/ml. 20 μl av varje koncentration pipetterades in i Concavus®deglar3 som omedelbart förseglades. För lösningen vid 24 mg/ml analyserades också en volym på 5 μl. Minst tre mätningar utfördes på varje prov. Referensdegeln fylldes med samma volym destillerat filtrerat vatten. Mätningarna utfördes under en inert atmosfär (dynamisk N2, 40 ml/min) med en uppvärmningshastighet på 10 K/min.
1 Hönsäggvita lysozym, ≥ 45 000 FIP U/mg, frystorkat, 14 kDa, Carl Roth GmbH + Co KG
2 Polyetersulfon - PES membranfilter, 450 μm
3 Concavus® 40 μl aluminiumdeglar, NETZSCH-Gerätebau GmbH
Mätresultat och diskussion
DSC-kurvorna för vattenlösningar av lysozym visar den typiska endoterma effekten i intervallet 75°C för alla uppmätta koncentrationer. Figur 3 visar typiska kurvor för lösningar med koncentrationerna 300, 200 och 20 mg/ml. Den extrapolerade starttemperaturen, topptemperaturen (Tm) och arean under kurvan (entalpi) varierar med koncentrationen. Ju högre provets massa i degeln är, desto bredare är den endotermiska effekten. Den breddande effekten observeras under variation av de extrapolerade start- och topptemperaturerna samt entalpin. De valda koncentrationerna är representativa för vanliga terapeutiska proteinläkemedel, som vanligtvis är högkoncentrerade, med proteindosen angiven i mg/kg kroppsvikt. Figur 4 visar provvolymens inverkan genom att visa DSC-kurvorna för lösningar vid 20 mg/ml (5 μl) och vid 5 mg/ml (20 μl).
De respektive massorna var 0,13 mg och 0,10 mg. Resultaten av alla mätningar sammanfattas i tabell 1.
Tabell 1: Karakterisering av lysozym med hjälp av DSC: koncentration, proteinmassa, volymer av uppmätta prover och respektive övergångstemperaturer (toppar) och entalpier (ytor)
Koncentration (mg/ml) | Provets volym (μl) | Koncentration (mM) | Proteinmassa (mg) | Area (J/g) | Topp (°C) |
|---|---|---|---|---|---|
| 300 | 20 | 21.4 | 6.37 ± 0.34 | 7.41 ± 0.12 | 73.0 ± 0.2 |
| 200 | 20 | 14.3 | 4.26 ± 0.14 | 3.56 ± 0.14 | 76.2 ± 0.4 |
| 20 | 20 | 1.7 | 0.51 ± 0.0 | 0.69 ± 0.05 | 77.4 ± 0.5 |
| 20 | 5 | 1.7 | 0.10 ± 0.0 | 0.78 ± 0.11 | 76.6 ± 0.2 |
| 5 | 20 | 0.36 | 0.10 ± 0.0 | 0.33 ± 0.19 | 79.3 ± 0.5 |
Sammanfattning
I den här studien användes DSC 300 Caliris® för att undersöka övergångstemperaturen för lysozym i ett brett spektrum av koncentrationer, från 5 till 300 mg/ml, vilket är representativt för kommersiellt tillgängliga proteinformuleringar. Även om högkoncentrerade lösningar användes, gjorde mätning på volymer så small som 5 μl det möjligt att spara de dyra formuleringarna med hög reproducerbarhet.
Sensorkänsligheten och möjligheten att använda small volymer i storleksordningen några mikroliter, tillsammans med möjligheten att ha en automatiserad provväxlare, gör DSC till en värdefull teknik för analys av biomolekyler. Beroende på uppvärmnings-/kylningshastigheten kan genomströmningen vara så hög som 3 prover per timme.